[发明专利]大肠杆菌表达载体、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种大肠杆菌表达载体pRTDuet-1，其特征在于，所述表达载体由pETDuet-1构建而来，其中所述pETDuet-1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。

2.根据权利要求1所述的表达载体pRTDuet-1，其特征在于，所述表达载体pRTDuet-1的核苷酸序列为序列号1所示的序列。

3.一种大肠杆菌表达载体pRTD-G，其特征在于，所述表达载体由权利要求2所述的pRTDuet-1构建而来，所述pRTD-G还包括目的基因，所述目的基因为6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体pRTD-G，其特征在于，所述目的基因来自于沼泽红假单胞菌。

5.根据权利要求4所述的表达载体pRTD-G，其特征在于，所述表达载体pRTD-G的核苷酸序列为序列号2所示的序列。

6.权利要求2所述表达载体pRTDuet-1以及权利要求5所述表达载体pRTD-G的构建方法，其特征在于，包括步骤：

(1)获得重组载体1，所述重组载体1包括了将pETDuet-1质粒MCSII区T7启动子替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段；所述重组载体1具有序列号3所示的序列；

(2)获得重组载体2，所述重组载体2包括了将pETDuet-1质粒MCSII区和MCS1区的两个T7启动子均替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段，所述重组载体2具有序列号4所示的序列；

(3)重组载体2和pETDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTDuet-1质粒；

(4)获得重组载体3，所述重组载体3为含6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因的片段；所述重组载体3具有序列号5所示的序列；

(5)将重组载体3与pRTDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTD-G质粒。

7.根据权利要求 6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒酶切位点设计两段式扩增引物对1与扩增引物对2；两段式扩增沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子，获得两段启动子片段，连接两段启动子片段，获得连接产物；将连接产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体1；所述引物对1的核苷酸序列分别如序列号6和序列号7所示序列，所述引物对2的核苷酸序列分别如序列号8和序列号9所示序列。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒MCSI区序列设计含酶切位点的长引物3；扩增长引物3和重组载体1的酶切片段，获得扩增产物，将扩增产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体2；所述长引物3的核苷酸序列为序列号10所示序列。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为根据pRTDuet-1质粒上的酶切位点设计引物对4，利用引物对4扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(g6pdh)基因片段；获得的基因片段与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体3；所述引物对4的核苷酸序列分别如序列号11和序列号12所示序列。

10.权利要求2所述表达载体pRTDuet-1以及权利要求5所述表达载体pRTD-G在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中的应用。