[发明专利]猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析

说明书

本发明公开了提供一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析的方法，从而成功制备出可以稳定遗传的产肠毒素性大肠杆菌菌影，并且还发现添加了佐剂的菌影疫苗可激发小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫，为进一步研制和开发大肠杆菌新型疫苗及新型佐剂进行前期的探索。本试验对更深入的研究猪ETEC菌影疫苗提供了一个较好的平台。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析方法

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)是引起人和幼畜肠道发生腹泻的主要病原体之一。初生仔猪感染产肠毒素性大肠杆菌后发病率和死亡率都很高。迄今为止，预防该病的疫苗主要包括传统的黏附素疫苗、肠毒素类疫苗和基因工程疫苗等，由于其免疫效果差或毒性反噬的存在，不能有效的控制该病。

菌影(bacterial ghosts)又称菌蜕，是一种新型的疫苗及佐剂形式，是无繁殖能力、缺乏细胞浆和核酸的细菌空壳，通过噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性菌内表达而形成。裂解基因E表达后，细菌的内外膜融合形成跨膜孔道，在渗透压的作用下，细菌基因组和胞浆等内容物通过跨膜孔道排出，留下细菌空壳，即形成一种空的“菌影”。相对于传统灭活疫苗来说，它的表面抗原结构得到最大程度的保留，免疫原性高，并可在其内部及外膜上负载外源抗原，成为优良的抗原递送载体，同时为联合疫苗的研究提供研究平台；在致病性微生物越来越难以控制的今天，菌影系统开始受到国内外研究者的关注。

细菌菌影作为新型疫苗，因其保留了细菌天然的表面抗原和结构，可诱导机体产生较强的细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫；同时菌影疫苗安全性高，制备简单且保存方便，所以研制猪ETEC菌影疫苗成为防控该病的最佳选择。

发明内容

本发明针对现有疫苗技术的不足，目的在于提供一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析的方法，从而成功制备出可以稳定遗传的产肠毒素性大肠杆菌菌影。并且还发现添加了佐剂的菌影疫苗可激发小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫。为进一步研制和开发大肠杆菌新型疫苗及新型佐剂进行前期的探索。

为实现上述发明目的，本发明采用的具体的技术方案为：

一种猪大肠杆菌菌影的制备及其免疫效力分析方法，具体包括：将含有噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR温控启动阻遏系统的表达载体pHH43，采用电击穿孔法转入ETEC中，成功构建重组的致病性ETEC。该重组菌37℃培养至OD_600nm值为0.6时，升温至42℃进行细菌裂解基因的表达；利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，并计算裂解效率达99.93％。透射电子显微镜观察，可见裂解后细菌仍保留原有形态结构，细菌内容物被排出，内部呈空洞，即为细菌空壳，成功制得猪ETEC菌影。随后对制备的ETEC菌影疫苗进行免疫效力评价，对150只25g的雌性昆明系小鼠进行免疫试验，观察小鼠的免疫能力。

上述方案中，所述的猪大肠杆菌菌影的制备步骤如下：

(1)将含有噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR温控启动阻遏系统的表达载体pHH43，采用电击穿孔法转入ETEC中，成功构建重组的致病性ETEC。

(2)将步骤(1)制得的重组菌37℃培养至OD_600nm值为0.6时，升温至42℃进行细菌裂解基因的表达，制备牛ETEC菌影。

(3)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，并计算裂解效率达99.93％。

(4)透射电子显微镜观察，可见裂解后细菌仍保留原有形态结构，细菌内容物被排出，内部呈空洞，即为细菌空壳。

上述方案中，所述制备菌影的方法具体包括如下步骤：

(1)猪大肠杆菌感受态的制备