[发明专利]一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法

说明书

一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法，根据Genbank中查找到的BaYMV基因的CP序列进行引物设计，获得LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，该LAMP引物组特异性强，减少了非靶标序列的影响，可以识别目的序列上6个不同的区域，具有高度的选择性，灵敏度高，检测方法具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点，可用于环介导逆转录等温扩增，通过添加显色剂用肉眼来直接观察检测结果，在保证实验结果准确性的同时，更加经济节约，高效，易于推广。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法。

背景技术

大麦黄花叶病主要是由大麦黄花叶病毒引起，借助于土壤中的禾谷多黏菌进行传播。上个世纪40年代日本首次对该病毒报道以来，已经在欧亚多个国家发现了该病毒的广泛分布。我国于上世纪50年代首次在浙江珠海农场发现大麦黄花叶病，因未重视，于上世纪70年代在我国长江流域大麦产区大规模爆发，造成了严重的危害。

目前，黄花叶病毒的检测方法有很多，包括电镜法、酶联免疫法(ELISA)、RT-PCR法、定量PCR和TaqMan探针法，等等。这些方法要么需要昂贵的仪器设备和复杂的操作方法，要么存在抗体制备难和假阳性的问题。

大麦黄花叶病毒是一种RNA病毒，属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属，其基因组由两个RNA分子RNA1和RNA2组成，分别约为7.6kb和3.5kb，这两个RNA分子被包被在一个丝状衣壳蛋白中形成大麦黄花叶病毒粒子(Chen et al.,1999)。RNA1编码8个蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶，基因组连接蛋白，衣壳蛋白，丝氨酸蛋白酶等；RNA2编码两个蛋白，分别为半胱氨酸蛋白酶和假定的载体感染因子(You and Shirako,2013)。

环介导到等温扩增法(LAMP)具备特异性强、操作简单、时间短、观察方便等优点，在病毒检测中发挥着重要的作用，目前，LAMP技术在我国还未被应用于大麦黄花叶病毒的检测。利用LAMP技术检测大麦黄花叶病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高时，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。

发明内容

本发明提供一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法，引物组由内外两对引物组成，具有高度的特异性，灵敏度高，可清晰检测植物RNA稀释浓度为0.001ng/μL中的病毒，具有高度的选择性，检测方法具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5’端到3’端，具体序列如下：

F3:5’-CGCAACTACAGTGATGAAAC-3’；

B3:5’-TCGGAAGTTAACATGGTGTT-3’；

FIP:5’-GAAGCGCCATGCTTCATTGATTTTCGTCTTACTCATCACA AACAAC-3’；

BIP:5’-CGATTTCTTCGTCCCACGATCATTTTTCAGTTCCAAGTGC TGCTA-3’。

本发明提供一种包含所述LAMP引物组的大麦黄花叶病毒的LAMP检测试剂盒。

进一步，所述LAMP检测试剂盒包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、buffer、dNTP、甜菜碱和Bst DNA聚合酶。