[发明专利]一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5’端到3’端，具体序列如下：

F3:5’-CGCAACTACAGTGATGAAAC-3’；

B3:5’-TCGGAAGTTAACATGGTGTT-3’；

FIP:5’-GAAGCGCCATGCTTCATTGATTTTCGTCTTACTCATCACAAACAAC-3’；

BIP:5’-CGATTTCTTCGTCCCACGATCATTTTTCAGTTCCAAGTGCTGCTA-3’。

2.一种包含权利要求1所述LAMP引物组的大麦黄花叶病毒的LAMP检测试剂盒。

3.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、buffer、dNTPs、甜菜碱和DNA聚合酶Bst。

4.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL。

5.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.8μM，内引物BIP为0.8μM，外引物F3为0.8μM，外引物B3为0.8μM，10×buffer，dNTPs为0.3mM、甜菜碱为0.6M，DNA聚合酶Bst为0.32U/μL。

6.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系中，还含有大麦黄花叶病毒的阳性质粒模板。

7.一种大麦黄花叶病毒的LAMP检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品总RNA，进行反转录，获得cDNA；

2)配制LAMP反应体系；

所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，10×buffer，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL；

3)进行LAMP扩增反应

利用步骤2)的LAMP反应体系，对步骤1)获得的cDNA进行LAMP扩增，以ddH₂O为阴性对照，以包含大麦黄花叶病毒目的序列的质粒为阳性对照，获得对应的扩增产物；

LAMP扩增反应的程序为：55-65℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)LAMP扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，观察颜色变化：阳性对照显色为绿色，阴性对照显色为橘色；待测样品显色为绿色的样品为阳性，含有大麦黄花叶病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含大麦黄花叶病毒。

8.根据权利要求6所述大麦黄花叶病毒的LAMP检测方法，其特征在于，在所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.8μM，内引物BIP为0.8μM，外引物F3为0.8μM，外引物B3为0.8μM，10×buffer，dNTPs为0.3mM、甜菜碱为0.6M，DNA聚合酶Bst为0.32U/μL。

9.如权利要求1所述LAMP引物组用于大麦黄花叶病毒的RT-LAMP检测方法中。

10.根据权利要求9所述的RT-LAMP检测方法中，其特征在于，所述RT-LAMP检测方法中，以含大麦黄花叶病毒的大麦叶片RNA为模板，反应体系中各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，10×buffer，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DTT为0.1-10mM，逆转录酶ReverTra Ace为1-5U/μL，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL，待测样品RNA≥0.001ng/μL，反应程序为：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。