[发明专利]反应动力学定量探测仪及转动马达ATP合酶活性检测方法

权利要求书

1.一种使用反应动力学定量探测仪检测ATP合酶活性的方法，其特征在于，

反应动力学定量探测仪包括：

测试转盘，所述测试转盘上设有测试样品池和对照样品池，所述测试转盘通过转轴连接电机，所述电机能够带动所述测试转盘转动和定位；

控制器，通过导线连接电机，用于控制电机的转轴转动和定位；

光电倍增管，通过导线连接所述控制器，用于采集测试样品池或对照样品池中的样品自发光的化学荧光，将所述化学荧光转换成电信号并发送给所述控制器的数据处理系统，所述控制器的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度；

所述电机还连接有码盘和码盘计数器，用于测试样品池或对照样品池的定位，所述码盘计数器通过导线连接所述控制器；

所述测试样品池和对照样品池对称设置在所述测试转盘的中心轴线的两侧，所述测试样品池和对照样品池位于所述测试转盘的同一条轴线上；

包括以下步骤：

(1)将转动分子马达ATP合酶F_oF₁ATPase、磷酸根Pi和荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；

(2)将所述混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；

(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中选择注入不同浓度的二磷酸腺苷ADP，则当注入其中一种浓度ADP时，测试样品池发生酶促反应：

根据上述反应可知：ADP通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度；

k₊表示ATP合酶F_oF₁ATPase同时与ADP和Pi的结合速率；k_--表示 F_oF₁ATPase与ADP和Pi完全解离的速率；k_cat表示F_oF₁ATPase对ADP的催化速率；

(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；

(5)针对不同标准浓度的ATP，测得每个浓度对应的ATP荧光强度F_ATP，进而生成校准曲线；

(6)制作米氏曲线：

根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α₆：

在线性区间:

[ATP]＝α₆F_ATP，

[ATP]表示ATP的浓度；F_ATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度；

V_ATP反应速率是所述的荧光强度时间曲线在起始点的导数：

t为检测时间，f_ATP为[ATP]对应的实时荧光强度；

基于终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度，不同浓度ADP存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出ADP浓度所对应的V_ATP，连接这些点，制作得到米氏曲线；

(7)求出Vmax：

根据米氏公式：

其中，[ADP]表示ADP的浓度；

拟合所得的Vmax即是衡量F_oF₁-ATPase活性的参数；

(8)按照以下方法判断F_oF₁-ATPase活性：

测试样品池中的转动马达数量：N_m＝N_Av×10^-3×30×10^-6＝3N_Av×10^-8；

每秒能合成ATP的数量：N_ATP＝40×N_m＝1.2N_Av×10^-6；

对应的每秒能合成的ATP mM数：V_ATPmax＝(N_ATP/N_Av)×10³/(100×10^-6)＝12mM/s；

如果拟合的Vmax1mM/s,则表明马达已经失活；

所述混合物中：所述转动分子马达ATP合酶F_oF₁ATPase的体积为30uL，浓度为1mM，所述Pi的体积为30uL，浓度为5mM，所述荧光素/荧光素酶的体积为10uL；

所述缓冲液加入量为30uL，所述缓冲液为BBS缓冲液，所述缓冲液的组分含量为：130mMNaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl₂，1mM MgSO₄，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH为7.4；

所述ADP选用的标准浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM，体积均为30uL。