[发明专利]一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用

说明书

本发明公开了一种高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用，包括：设计针对野生型基因的野生型上游或下游引物、针对突变型基因的突变型上游或下游引物、通用的上游或下游引物、突变型blocker和野生型blocker；采用双管PCR体系进行PCR反应，对样本进行定量PCR检测；其中，一管包括野生型引物、突变型blocker和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker和通用引物。本发明的高灵敏的基因突变检测方法，通过特异性引物合并特异性blocker的方法，提高了检测的特异性和灵敏度；本发明通过标准品以及标准曲线的绘制，很好的避免了假阳性和假阴性结果；本发明具有检测万分之一及其以上基因突变的能力。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种高灵敏的基因突变检测体系、方法和应用。

背景技术

基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，如单核苷酸多态性(SNPs)以及未甲基化的核苷酸被转化后碱基的变化。

单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A，G，C，T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。 SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs。SNPs和疾病的发生发展密切相关。

细胞基因的甲基化和肿瘤的发生、发展密切相关，非甲基化的胞嘧啶(C)在亚硫酸氢盐作用下转化为尿嘧啶(U)，从而成为具有检测价值的突变位点。

目前市面上针对基因突变检测的方法有许多，包括一代测序、二代测序，基因芯片、荧光定量PCR(qPCR)技术等。但是在较高的野生型模板的背景下，针对稀有的基因突变的检测能力有限。

稀有基因突变，指的是存在大量野生基因序列背景中的极为稀少的基因序列。在癌症病人或是治疗后病人血液中含有少量的肿瘤突变 DNA(ct-DNA)以及含有甲基化位点的DNA；孕妇外周血含有少量的胎儿DNA等，这些情况都属于大量野生型背景下的稀有基因检测。许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所提的 DNA也是带有大量野生型DNA，同样需要采用稀有基因突变的检测方法。因此，稀有基因突变的检测在癌症筛查和预后跟踪、无创产前筛查等具有十分重要的意义。

和测序技术检测基因突变相比，qPCR技术具有迅速、方便、价格低等优点，可以做到对基因突变的高灵敏检测。评价基因突变检测方法的优劣包括：灵敏度、特异性、简便程度等。灵敏度是指在大量野生型DNA背景下能够检测到的最小突变型的量；特异性是指不被检测到的最大突变型的量。基于PCR技术的稀有基因突变检测方法可以归为两类：(1)特异性引物扩增方法；(2)非特异性引物加特异性blockers的方法.第一类的特异性引物扩增的方法有ARMS (amplification refractory mutation system),ASB-PCR(allele-specificblocker PCR),以及castPCR(competitive allele specific TaqMan PCR)。第二类方法包括PNA blocker PCR和COLD-PCR(co-amplification at lower denaturationtemperature PCR)等.以上的方法具有高灵敏检测基因突变的能力，但是需要碱基的修饰、特殊的反应试剂或特殊的反应程序等，因此有必要研发一种简单的、灵敏度更高的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用。