[发明专利]一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用

权利要求书

1.一种高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，包括：

针对野生型基因的野生型引物、针对突变型基因的突变型引物、通用引物、突变型blocker引物、野生型blocker引物和通用型探针；野生型引物为野生型上游引物或野生型下游引物；突变型引物为突变型上游引物或突变型下游引物；通用引物为通用上游引物或通用下游引物；

所述的基因突变检测体系为双管PCR体系，其中一管包括野生型引物、突变型blocker引物和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker引物和通用引物；

所述野生型引物和野生型模板互补，所述突变型引物和突变型模板互补；所述野生型引物和突变型引物的3’端的末端碱基不同或在引物序列中间的一个碱基不同，其它序列相同；所述野生型引物和突变型引物的长度为15-35个碱基；

所述通用引物分别和所述野生型模板、突变型模板均互补，其长度为15-35个碱基；

所述野生型blocker引物和野生型模板互补，所述突变型blocker引物和突变型模板互补；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的5’端的末端碱基不同或由5’端到引物序列中间所组成的序列片段的一个碱基不同，而其它序列相同；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的长度为15-40个碱基；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物不可以发生扩增，所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的3’端被修饰基团修饰或3’端有若干个和所述野生型模板、突变型模板均不互补的碱基；

所述的通用上游引物选自：

5’-ACCAGTTGGGCATGTTGA-3’ SEQ ID NO：1；

5’-AGCATTGGAATCCAGAAACCAG-3’ SEQ ID NO：2；

5’-GAATCCAGAAACCAGTTGGGC-3’ SEQ ID NO：3；

5’-TCTCCCTCCCTCCAGGAAGC-3’ SEQ ID NO：4；

5’-GACCGTCGCTTGGTGCA-3’ SEQ ID NO：5；

5’-TACTTGGAGGACCGTCGCT-3’ SEQ ID NO：6；

5’-AGGGCATGAACTACTTGG-3’ SEQ ID NO：7；

野生型下游引物选自：

5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’ SEQ ID NO：8；

5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’ SEQ ID NO：9；

5’-GCA CCC AGC AGT TTG GCCG-3’ SEQ ID NO：10；

5’-CGA AGG GCA TGA GCT GCG-3’ SEQ ID NO：11；

突变型blocker引物选自：

5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’ SEQ ID NO：12；

5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTAC-3’ SEQ ID NO：13；

5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’ SEQ ID NO：14；

5’-ATG ATG AGC TGC ACG GTG GAG GTG AGG CAG-3’ SEQ ID NO：15；每一个突变型blocker引物的3’端采用磷酸化修饰；

突变型下游引物选自：

5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATG-3’ SEQ ID NO：16；

5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’ SEQ ID NO：17；

5’-GCA CCC AGC AGT TTG GCCG-3’ SEQ ID NO：18；

5’-CGA AGG GCA TGA GCT GCA-3’ SEQ ID NO：19；

野生型blocker引物选自：

5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’ SEQ ID NO：20；

5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’ SEQ ID NO：21；

5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’ SEQ ID NO：22；

5’-AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA TGC TGC G-3’ SEQ ID NO：23；

5’-AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA TGC T-3’ SEQ ID NO：24；

5’-GTG ATG AGC TGC ACG GTG GAG GTG AGG CAG-3’ SEQ ID NO：25；每一个野生型blocker引物3’端采用磷酸化修饰；

通用型探针选自：

5’-CTGAAAAGTACCTCCATTCGGGT-3’ SEQ ID NO：26；

5’-TTGCTGAAAAGTACCTCCATTCGG-3’ SEQ ID NO：27；

5’-TTTCAC CAG TAC GTT CCT GGC TGC-3’ SEQ ID NO：28；

5’-CAC CAG TAC GTT CCT GGC TGC CA-3’ SEQ ID NO：29；

5’-CAC GTG GGG GTT GTC CAC GCT G-3’ SEQ ID NO：30；

野生型模板选自：

5’-ACCAGTTGGGCATGTTGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTTTCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTCATTGCAGAGAGAGGACTTGG-3’ SEQ ID NO：31；

5’-ATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCT-3’ SEQ ID NO：32；

5’-CTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCA-3’ SEQ ID NO：33；

突变型模板选自：

5’-ACCAGTTGGGCATGTTGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTTTCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTGATTGCAGAGAGAGGACTTGG-3’ SEQ ID NO：34；

5’-ATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCT-3’ SEQ ID NO：35；

5’-CTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCA-3’ SEQ ID NO：36。