[发明专利]一种甲壳素酶及其应用

说明书

本发明的目的在于提供一种具有高效降解率的甲壳素酶，通过克隆白长链霉菌Streptomyces albolongus ATCC 27414基因组中编码甲壳素酶的基因，并构建重组载体，将其转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达，得到高活性的可溶性甲壳素酶。通过Ni柱亲和层析，纯化得到甲壳素纯酶，并对其酶学性质和水解机制进行研究，该酶的最适温度和最适pH分别为55℃和5.0，比酶活为66.2U/mg,降解甲壳素的主要产物为甲壳二糖。有望将本发明应用于甲壳寡糖的制备，具有潜在应用价值。

技术领域

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种甲壳素酶及其应用。

背景技术

甲壳素又称甲壳质、几丁质等，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)，通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性高分子多糖聚合物，甲壳素广泛存在于甲壳类动物外壳、真菌细胞壁、昆虫、藻类细胞以及软体动物的软骨或内壳，是自然界中仅次于纤维素的第二大多糖聚合物。但是甲壳素的不溶性是甲壳素应用的最大限制性因素，而甲壳素的降解产物甲壳寡糖(聚合度为2～10)，具有更广泛的生物活性，如；抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、治疗关节炎、肠道炎等药理功能活性，此外，甲壳寡糖也是肠道有益菌群的促生长因子，可作为功能性食品或饮料的补充剂。因此，制备甲壳寡糖是近年来国内外研究的热点，而且也是甲壳素高值化利用的有效途径。

目前，甲壳寡糖的制备方法主要分为：化学法、物理法和酶法。化学法主要利用盐酸、过氧化氢等化学试剂降解甲壳素，得到分子量3000的低聚糖，但是由于反应条件比较剧烈，反应过程无法控制，反应产物纯度较低，而且需要消耗大量化学试剂，不仅造成资源的大量浪费，而且容易给环境带来负担。物理法是利用超声波、微波、γ射线和光等能量使甲壳素降解，但是物理法制备的产物产量低，产物分布不均一，在工业化生产中没有得到广泛的应用。酶法制备甲壳寡糖，反应条件较温和，反应过程容易控制，且产物较纯易分离，对大规模生产甲壳寡糖具有重要意义；但目前缺少特异性降解甲壳素来制备特定甲壳寡糖的甲壳素酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲壳素酶及其应用，克服目前现有技术的不足；

本发明的提供的甲壳素酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

用于编码上述甲壳素酶基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明提供一种表达载体，用于表达上述的甲壳素酶；

本发明还提供一种转化体，携带有上述的重组表达载体；

本发明再一个方面提供一种制备甲壳二糖的方法，是使用上述的甲壳素酶降解甲壳素来制备甲壳二糖。

本发明的甲壳素酶用于降解胶质甲壳素，主要产物为甲壳二糖，产量达72％，次要产物为N-乙酰-D-葡萄糖胺，产量达38％。

附图说明：

图1：本发明的甲壳素酶亲和层析后的SDS-PAGE电泳图，1：Marker；2：粗酶；3：纯酶

图2：本发明的甲壳素酶，pH变化对相对酶活的影响。

图3：本发明的甲壳素酶，温度变化对相对酶活的影响。

图4：本发明的甲壳素酶作用于甲壳六糖，产物的变化趋势。

图5：本发明的甲壳素酶，酶解产物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明的的方法作进一步说明，实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

对于本发明所涉及的术语如下：