[发明专利]一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法

说明书

本发明公开了一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，该方法包括将分布于棉花A亚组或D亚组全基因组26条染色体上的52对核心引物进行多重荧光PCR组合，提取棉花DNA作为待测样品，使用52对核心引物按照多重荧光PCR组合方式组合得到的5个组合分别对待测样品进行pSSR‑PCR扩增反应，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行毛细管四色荧光电泳检测与数据分析。本发明能极大地提高检测通量，检测效率高，该方法尤其适用于大批量棉花品种DNA指纹库的构建。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法。

背景技术

棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。据统计，2000—2009年我国通过国家审定及省级审定的棉花品种数量700多个。截止到2012年2月29日，已申请植物新品种保护的棉花品种达335个。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在棉花育种中的大规模应用，棉花品种间的遗传差异越来越小,使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别愈加困难。同时由于形态鉴定的时效性差，工作量大，容易受到环境与主观因素的影响，品种多乱杂的现象难以得到有效控制。

DNA分子标记技术的发展促进了品种鉴定技术的进步。其中SSR标记技术以其扩增稳定、多态性丰富、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于水稻、玉米、棉花、小麦等农作物的品种鉴定。多色荧光检测技术是以不同颜色的荧光染料标记在SSR引物的5′端，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，并通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小，这样既能提高检测效率又能保证数据的准确性。

然而，常规基于棉花SSR的多色荧光标记检测技术构建我国棉花品种DNA指纹库的方法，是将每对核心引物分别对待测样品进行SSR-PCR扩增反应，即进行单重SSR-PCR扩增反应，这样就得进行大量的SSR-PCR扩增反应，进而会大大地降低检测效率，尤其在进行大批量棉花品种DNA指纹库的构建时，检测效率非常低，而且在对扩增产物进行毛细管荧光电泳检测时，每次检测所用时间较长，这样也会降低检测效率。

发明内容

本发明提供一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，能极大地提高检测效率，以克服现有技术存在的不足。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于毛细管四色荧光电泳检测系统和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将分布于棉花A亚组或D亚组全基因组26条染色体上的52对核心引物进行多重荧光PCR组合，其中每对核心引物标记有荧光染料，

所述核心引物的核苷酸序列如下表1所示：

表1

本发明依据以下多重荧光PCR组合的基本原则：①组合中标记相同荧光的各引物，其扩增产物片段范围不能交叉；②避开非特异扩增产物峰的相互影响；③采用四色荧光标记系统：其中，ROX为红色荧光，FAM为蓝色荧光，HEX为绿色荧光，分子量内标Liz-500为橙色。

所述52对核心引物的多重荧光PCR组合方式如下表2所示：

表2

(2)提取棉花DNA作为待测样品；

(3)使用步骤(1)中52对核心引物按照多重荧光PCR组合方式组合得到的5个组合分别对待测样品进行pSSR-PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；