[发明专利]一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法

权利要求书

1.一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将分布于棉花A亚组或D亚组全基因组26条染色体上的52对核心引物进行多重荧光PCR组合，其中每对核心引物标记有荧光染料，

所述核心引物的核苷酸序列如下所示：

所述52对核心引物的多重荧光PCR组合方式如下所示：

(2)提取棉花DNA作为待测样品；

(3)使用步骤(1)中52对核心引物按照多重荧光PCR组合方式组合得到的5个组合分别对待测样品进行pSSR-PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

(4)将步骤(3)中的PCR扩增产物进行毛细管四色荧光电泳检测与数据分析。

2.根据权利要求1所述的基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，其特征在于：所述52对核心引物分别取自棉花A亚组和棉花D亚组各26对。

3.根据权利要求1所述的基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取棉花DNA包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mL RNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。

4.根据权利要求3所述的基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取棉花DNA包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μL SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μL体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/mL的1μL RNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μL TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

5.根据权利要求1所述的基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，其特征在于，步骤(3)中各个组合所对应pSSR-PCR扩增反应的反应液包括对应组合所有引物、PCR Buffer缓冲液、dNTPs、DNA模板、Taq HS聚合酶以及ddH₂O。