[发明专利]基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法

说明书

本发明公开一种基于核酸染料TOTO‑1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本方法步骤如下：1）细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞溶液；2）将裂解后的细胞溶液加入端粒酶扩增缓冲溶液，对端粒酶引物进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；3）加入TS primer的互补序列，杂交后，再加ExoⅢ酶切除双链，最后加TOTO‑1，孵育，检测荧光光谱。本发明利用了TOTO对含G碱基DNA链的识别作用来检测端粒酶，简化了检测方法，避免了标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，涉及一种荧光法定量检测端粒酶的技术，具体涉及基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。

背景技术

传统的检测方法主要是利用聚合酶链式反应(PCR)法对端粒的重复序列进行扩增。此方法稳定性好，特异性高，但是需要样品量较大，灵敏性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测。此外，TRAP法需要使用昂贵的设备和试剂，再加上端粒酶抑制剂的开发已被提议作为人类癌症治疗的潜在方法，而TRAP在筛选有效的端粒酶抑制剂时易受PCR派生产物的影响，因此，该方法存在很多局限性。荧光不仅价格便宜，不需要复杂的仪器设备，而且测量简便、快速，因而得到了较快的发展。

虽然后续有一些研究者提供了很多方法来检测端粒酶，但是大多数需要借助纳米材料制备、比较贵重的仪器或比较复杂的荧光循环步骤，考虑到生物体本身复杂的环境，涉及的物质和操作过程越多，实验的重现性和准确性越差。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本发明针对TOTO-1与TS Primer扩增后的链结合荧光强度会发生明显变化，从而建立荧光法检测端粒酶，同时结合ExoⅢ来降低该实验方案的背景干扰，通过荧光强度的改变可以对端粒酶进行定量检测。本发明是利用TOTO-1对TSPrimer扩增出的富G序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入ExoⅢ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。

技术方案：本发明提供了一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：

1)细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；

2)将裂解后的细胞溶液加入含有端粒酶扩增引物(TS primer)的端粒酶缓冲溶液，对TS primer进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；

3)在产物溶液中加入TS primer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；

4)在杂交好的产物中再加ExoⅢ酶切除双链，最后加TOTO-1，孵育，检测荧光光谱。

其中，所述步骤1)的细胞的培养以及提取端粒酶的提取具体步骤如下：A549肺癌细胞加入含10％FBS和双抗的DMEM培养基，在含5％CO₂，37℃细胞培养箱培养后收集，4×10⁶个细胞分散在1.5mL的EP管中，用1×PBS在1800rpm离心机清洗5min后，弃去上清液，将这些收集到的细胞分散在裂解液中，冰上孵育30min后，12000rpm，4℃下离心20min，将上清液转移到无RNase离心管，快冻后保存在-80℃冰箱中。

其中，所述步骤1)细胞数目为2～4000个。

其中，所述步骤2)具体步骤如下：用端粒酶缓冲溶液将细胞配置成不同的浓度，在含有dNTPs、端粒酶扩增引物的端粒酶缓冲溶液中滴加不同浓度的裂解后的细胞溶液对其引物进行扩增延伸，37℃反应1～2h。