[发明专利]一种单细胞基因组拷贝数变异的检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及组合物、试剂盒及其用途。本申请包含整套单细胞基因组拷贝数变异检测的解决方案，包括单细胞扩增、文库构建、高通量测序和信息分析，将基于转座酶的文库构建应用于单细胞测序，使用单管一步建库的操作过程，降低了操作的繁琐程度，避免了污染。此外，本发明还根据CNV最低检出分辨率的要求提供了最优窗口长度，利用游程检验统计了CNV区域与正常区域测序数据相对覆盖度的分布差异，在最后结果中输出每个候选CNV的显著性P值，有效提高检测准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种单细胞基因组拷贝数变异的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，可用于检测单细胞基因组拷贝数变异(包含染色体非整倍体和染色体微扩增微缺失)，揭示细胞群中个体差异和细胞进化关系。

对于单细胞全基因组测序来说，单细胞扩增产物的文库构建流程涉及到 DNA片段化、末端补平、腺苷化、接头连接、PCR扩增，每个反应步骤后均需磁珠纯化。随着文库构建技术发展，一些快速建库方法可将末端补平和腺苷化一步完成，此步骤反应完成后可不进行磁珠纯化，在一定程度上简化了建库流程，但整个文库构建仍需3-4步才能完成，存在多次转管和纯化，易导致核酸损失和导致均一性较低，染色体微扩增微缺失(CNV)检出准确性降低。

基于转座酶的文库构建方法越来越多的应用于高通量测序中，与传统建库方法相比，基于转座酶的文库构建方法可实现片段化、末端补平和接头连接一步反应，反应后进行一步PCR扩增即可完成文库构建，整个流程中需两步纯化。该方法较传统建库方法反应步骤有所降低，但片段化步骤后仍需进行纯化，无法实现单管一步反应。此外，现有的商品化Tn5酶只能针对某一固定数值的核酸量进行酶切(如illumina Nextera试剂盒只能针对50ng，1ng～5ng分别采用不同规格的试剂盒进行建库)。

对单细胞进行CNV检测的数据分析流程主要步骤是将测序数据比对到参考基因组上，然后将基因组划分成连续的窗口，对每个窗口比对上的reads 数进行标准化，最后筛选出比对上的reads数连续偏高或偏低的窗口作为候选CNV。现有技术对于窗口长度和CNV的选取常导致假阳性结果。现有技术对于窗口长度的选择通常是针对特定的研究目的，测序数据量不同，检出 CNV分辨率要求不同，需要的最优窗口长度也不一样，同样的数据使用窗口过大可能导致假阴性结果，窗口过小可能导致假阳性结果。同时在检测CNV 过程中，由于基因组存在一些结构特殊区域(重复区域，低比对区域等)，容易检出假阳性结果，对这些检出的候选CNV进行显著性评估显得尤为重要。因此，提供一种操作简便、成本较低、特异性强、敏感性高的单细胞基因组 CNV检测方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了组合物、试剂盒及其用途。本发明不需要借助正常样本即可对每个窗口比对上的reads数进行标准化，使每个窗口的reads 数分布更均一，不仅可以节约成本还能简化分析过程。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了Tn5蛋白复合物，包括Tn5蛋白和oligo，所述oligo包括 OligoA、Oligo5X和Oligo7X中的一种或两者以上的混合物；

其中，OligoA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

Oligo5X的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

Oligo7X的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。