[发明专利]一种高产二萜类成分的酵母工程菌

说明书

本发明涉及一种高产二萜类化合物的酵母工程菌，所述酵母工程菌包括过表达GGPP代谢流的基因，并且敲除了ROX1、YJL064w、YPL062w或ERG9p基因中的任意一种或多种。经本发明改造的酵母工程菌，与未改造前的酵母工程菌相比，具有更高的GGPP表达水平，并且，在改造后的酵母工程菌中导入二萜类化合物合成酶基因，所得的菌株具有更高的生产二萜类化合物的水平。

技术领域

本发明涉及一种高产二萜类成分的酵母工程菌，具体涉及到一种敲除了ROX1基因、 YJL064W基因、YPL062W基因、ERG9p基因中的任意一种或多种酵母工程菌，属于药用植物基因工程领 域。

背景技术

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP)是二萜类物质(包括丹 参酮、β-胡萝卜素、雷公藤二萜类化合物如雷公藤甲素、紫衫二烯等)的生物合成关键前体 物质。二萜类化合物通常以GGPP为底物，在二萜合酶复合体的催化作用下形成，即异戊烯 焦磷酸(Isopentenyl Pyrophosphate，IPP)通过一系列的反应形成GGPP后，二萜合酶复合体 以GGPP为其底物，经过最初的离子异构化后环化形成各种阳离子中间产物，最终通过去质 子或捕获亲核物质进一步环化形成一系列二萜骨架中间体，并通过细胞色素P450结构修饰， 主要包括羟基化、甲基化、异构化、脱甲基化、加成和还原等，最终生成二萜类化合物。

如丹参酮类化合物为松香烷型二萜醌类化合物，其生物合成在萜类化合物前体物质合成 的基础上，通过异戊二烯基转移酶(Prenyl Transferases，PT)的作用产生20个碳原子的GGPP， GGPP进一步在丹参柯巴基焦磷酸合酶(S.miltiorrhiza CopalylDiphosphate synthase,SmCPS) 和丹参类贝壳杉烯合酶(S.miltiorrhiza ent-kaureneSynthase,SmKS)的作用下形成丹参酮类 化合物的基本骨架次丹参酮二烯，在次丹参酮二烯的基础上经过甲基化和羟基化等形成丹参 酮类化合物，其中细胞色素P450酶在修饰的过程中发挥着重要作用。

短叶红豆杉来源的紫衫二烯合成酶催化GGPP合成紫衫二烯，可通过将该基因导入底盘 细胞中进行生物合成紫衫二烯(CN105820866A)、GGPP在八氢番茄红素合酶的作用下可以 合成八氢番茄红素(CN106282207A)。

雷公藤甲素与丹参酮类化合物同属松香烷型二萜，目前已经证实丹参中的SmCPS与 SmKS基因以及雷公藤中的TwCPS1与TwTS基因均能催化GGPP形成松香烷型二萜化合物前体次丹参酮二烯。

活性成分含量的积累一直是药用植物研究关注的重点，目前许多重要活性成分的获取仍 然依赖于对原植物的提取，如果能够在微生物中构建重要次生代谢物的生物合成途径，实现 化合物低成本、高产量的生产，这将在很大程度上减少药用植物的采挖，促进资源的可持续 发展。

酿酒酵母因其遗传背景清楚、扩繁操作简单、生物安全性高等特点，被广泛的用作真核 表达系统。酿酒酵母中MVA途径(mevalonic acid pathway)代谢流较强，可以生成FPP(farnesyl diphosphate)、GGPP等倍半萜类、三萜类和二萜类化合物的共同前体物质。

发明内容

本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术改造影响萜类前体物质含量积累的基因，达到提 高萜类化合物生物合成产量的目的。

本发明涉及一种改造的酵母工程菌，在所述酵母工程过表达了HMGR、ERG20/BTSI融 合基因或嗜酸热硫化叶菌的SaGGPS等增强GGPP代谢流的基因中的任意一种或多种，以提 高GGPP在酵母菌种的表达。