[发明专利]一种KRAS基因突变检测的引物探针组合及其应用

说明书

本发明涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种KRAS基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括KRAS基因突变检测特异性引物对、KRAS基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述KRAS基因的突变检测的位点为外显子1的12和13密码子，具体为G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V和G13D突变位点。本发明对KRAS基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以对肿瘤组织样本进行检测，能够辅助临床治疗，具有重要价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种KRAS基因突变检测的引物探针组合及其应用。

背景技术

肺癌、结直肠癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中肺癌以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。KRAS基因位于染色体12p12.1，是重要的癌基因之一，编码一种21kD的KRAS蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括RAS/P13K/PTEN/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK 信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。研究表明，非小细胞肺癌、结直肠癌组织存在 KRAS基因突变，KRAS基因第12和13密码子发生突变，将导致KRAS蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。

KRAS基因突变可导致EGFR信号通路下游持续激活，是TKI原发耐药机制之一。大量临床研究表明，靶向药物对于未发生KRAS基因突变的患者有效率可达到60％，而对已发生KRAS基因突变的患者则完全无效。但是，2010年 10月最新研究发现第13密码子上的G13D突变亦对抗体类药物有治疗反应性。通过检测K-ras基因有没有突变，可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。对于没有突变的患者，则能减少不必要的治疗费用和毒副作用。KRAS 基因突变对癌症的发生、形成过程起重要作用。最常见的突变位点90％-97％发生在在外显子1的12和13密码子，其中70％发生于第12密码子，30％发生于13密码子。

对K-ras突变的检测方法有直接测序法、突变体富集PCR、ARMS-PCR、高分辨率熔解曲线(HRM)以及TaqMan-MGB法等，直接测序敏感性低，费用高；突变富集体PCR容易造成PCR的污染而导致假阳性；HRM对模板的要求高，敏感度不高；TaqMan-PCR在敏感度和准确性上均有所提高，但是 ARMS-MGB法要比TaqMan-PCR敏感度、准确性还高，且特异性很高。

ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System，突变扩增阻滞系统)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。ARMS技术利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因(即利用特异引物对突变靶序列进行高精准的PCR扩增放大)；同时利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。

市场上已有采用ARMS-PCR的检测试剂，CN 105567854 A公开了一种检测人EGFR、KRAS、KRAS基因突变的ARMS引物，其在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，使其成为双内参系统和双重判读规则的试剂盒。CN102367478 A公开了一种用于 KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括 qPCR混合反应液、锁核酸阻滞探针、参照引物、ARMS引物和阳性对照样品。但现有的方法ARMS-PCR的检测试剂检测精准度和特异性不够高，难以在大范围内普及使用。