[发明专利]一种KRAS基因突变检测的引物探针组合及其应用在审
| 申请号： | 201810166548.1 | 申请日： | 2018-02-28 |
| 公开（公告）号： | CN108220444A | 公开（公告）日： | 2018-06-29 |
| 发明（设计）人： | 盛青松;白静;姚鲁帅 | 申请（专利权）人： | 无锡禾盛医疗器械有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 巩克栋 |
| 地址： | 214174 江苏省无锡市惠山经*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 突变检测 引物探针 探针 检测引物 特异性探针 特异性引物 基因突变 检测结果 临床治疗 特异性强 突变位点 肿瘤组织 灵敏度 密码子 外显子 检测 扩增 位点 内参 突变 样本 应用 | ||
1.一种KRAS基因突变检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括对KRAS基因突变检测特异性引物对、KRAS基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；
其中，所述KRAS基因的突变检测的位点为外显子1的12和13密码子，具体为G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V和G13D突变位点。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述KRAS基因突变检测特异性引物对的错配率为15-30％，优选为20-25％；
优选地，所述扩增阻断探针与KRAS基因突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，优选为6-9bp。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述扩增阻断探针的3’端磷酸化；
优选地，所述KRAS基因特异性探针和所述扩增阻断探针的5’端带有荧光基团；
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED；
优选地，所述KRAS基因特异性探针和所述扩增阻断探针的3’端带有淬灭集团；
优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合，其特征在于，所述KRAS基因突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9所示；
优选地，所述KRAS基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示；
优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12-14所示；
优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针；
优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
5.一种检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液；
优选地，所述阳性质控为KRAS基因G12A突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQID NO.18所示；
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
7.一种利用如权利要求5或6所述的试剂盒用于检测KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、KRAS基因突变检测特异性引物对、KRAS基因特异性探针、扩增阻断探针、内参引物对、内参探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
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