[发明专利]一种基于三次延伸-RNA扩增介导的生物大分子免疫分析方法

说明书

本发明公开了一种基于三次延伸‑RNA扩增介导的生物大分子免疫分析方法，属于免疫学领域。该方法将生物大分子与识别生物大分子的物质偶联的oligo1和oligo2接触，oligo1一端为标签序列，另一端序列（长约6nt）可以和oligo2末端互补配对；oligo2，一端为T7启动子序列，另一端序列（长约6nt）可以和oligo1末端互补配对；在Klenow酶的作用下进行延伸，形成dsDNA，在T7聚合酶的作用下转录出小RNA分子；利用小RNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测小RNA，由此判断待检生物大分子的存在与否。该法灵敏度高、对仪器的要求低，可用于生物医学指标的超敏检测。

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种基于三次延伸-RNA扩增介导的生物大分子免疫分析方法。

背景技术

数十年来，免疫学方法如酶联免疫法(ELISA)已被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。ELISA为基础的产品具有使用简单、通用性高以及成本相对较低的特点。但是，像任何其他技术一样这些普通的免疫学方法都有局限性，最主要的问题就是其检测的敏感度不高，难于检测超低量的蛋白质，而这些超低量蛋白质对于像冠状动脉疾病、卵巢肿瘤、以及老年痴呆症这样的疾病的早期诊断至关重要。因此，建立一种超高敏感的生物大分子检测技术显得尤为必要。

免疫-聚合酶链反应(Immuno-PCR，iPCR)已成为一个强有力的技术，在检测靶标蛋白时灵敏度比常规ELISA方法高100～10000倍。这种方法学灵敏度的提高是通过对抗体偶联核苷酸进行PCR扩增而实现的。但是这种设计存在许多缺陷，即设计的与抗体偶联的核苷酸都较长，如在邻位连接技术(Proximity ligation assay，PLA)和邻位延伸技术(Proximity extension assay，PEA)中使用的一对核苷酸片段都较长，约40-60核苷酸，这两种技术中较长核苷酸的设计是便于下一步的PCR分子扩增。这种较长探针设计的缺陷在于核苷酸偶联抗体后的复合物与游离的核苷酸很难分离，常规的分离方法比如HPLC分离纯化，需要一定的抗体量才能进行有效分离，当标记的抗体量很少时仍然很难实现有效分离。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种基于三次延伸-RNA扩增介导的生物大分子高敏免疫分析方法，即免疫-TEBRA(triple extension-based RNAamplification)。该方法具有高灵敏度、抗体用量小、对仪器的要求较低的特点，可用于生物医学指标的超敏检测，还可用于以监测生物标志物浓度为基础的新药筛选平台的建立。

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过以下技术方案实现：

本发明第一方面，提供一种基于三次延伸-RNA扩增介导的生物大分子免疫分析方法，包括以下步骤：

1)相关探针及引物的设计：

(1)第一和第二邻近探针的设计：oligo1，总长为20-30nt的DNA，一端为标签序列ZC，另一端序列(长为5～6nt)可以和oligo2末端互补配对；Oligo2，总长约20-30nt的DNA，一端为T7启动子序列，另一端序列(长为5～6nt)和oligo1末端互补配对；

Oligo1和oligo2分别与识别生物大分子的物质偶联，形成识别生物大分子的物质-oligo1、识别生物大分子的物质-oligo2，标记oligo1和oligo2的物质是结合生物大分子的抗体、或具有亲和能力的生物素；由于设计的这对oligo长度较短(约20-30nt)，偶联后可以通过简单的离心柱层析法即实现偶联了识别生物大分子的物质的oligo与游离oligo分开；