[发明专利]一种基于三次延伸-RNA扩增介导的生物大分子免疫分析方法

权利要求书

1.一种基于三次延伸-RNA扩增介导的生物大分子免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）相关探针及引物的设计：

（1）第一和第二邻近探针的设计：oligo1，总长为20-30nt的DNA，一端为标签序列ZC，另一端长为5~6nt序列可以和oligo2末端互补配对；Oligo2，总长为20-30nt的DNA，一端为T7启动子序列，另一端长为5~6nt序列和oligo1末端互补配对；

Oligo1和oligo2分别与识别生物大分子的物质偶联，形成识别生物大分子的物质-oligo1、识别生物大分子的物质-oligo2，标记oligo1和oligo2的物质是结合生物大分子的抗体、或具有亲和能力的生物素；由于设计的这对oligo长度较短，为20-30nt，偶联后可以通过简单的离心柱层析法即实现偶联了识别生物大分子的物质的oligo与游离oligo分开；

（2）扩增引物R，命名为oligo3：oligo3有两个部分，3’端与转录的小RNA一半的序列互补配对，即通过10或11核苷酸长度与转录的小RNA的3’端的半个分子杂交；另一端是标签序列ZC1和/或ZC2及T7启动子序列；根据标签序列设计捕获探针和检测探针，用于对后续扩增产物的定性分析，标签序列根据需要进行设计，为1-2条，长度为16~20nt；T7启动子序列是T7 聚合酶识别位点，用于后续的T7聚合酶转录；

（3）稳定序列1：为了增加oligo3和转录的小RNA杂交体的稳定性，引入稳定序列1，其与标签序列ZC1和/或ZC2以及T7启动子互补配对结合；

（4）扩增引物F，命名为oligo4：与oligo3特征相似，有两个部分，一端与转录的小RNA的5’端的半个分子序列相同，长度为10~11核苷酸，可与转录的小RNA全长的cDNA序列互补配对结合；另一端含有一个标签序列ZC3，该标签序列可以用于后续扩增产物定性检测时捕获探针或检测探针的设计；

（5）稳定序列2：为了增加oligo4和新合成的oligo3-RNA~cDNA结合的稳定性，引入稳定序列2，其特征为可以和标签序列ZC3互补配对结合；

2）生物大分子检测

（1）在一个单项反应的试管中识别生物大分子的物质-oligo1和识别生物大分子的物质-oligo2同时结合靶标生物大分子，由于邻位的原因，oligo1和oligo2尾部的6个核苷酸分子会互补配对结合，然后在Klenow 酶的作用下进行延伸，形成一个dsDNA，此为第一次序列延伸；

（2）步骤（1）形成的dsDNA由于含有T7启动子，在T7聚合酶的作用下转录出小RNA分子，大小为20~25nt；

（3）oligo3和步骤（2）转录的小RNA 3’端一半的序列结合，形成小RNA-oligo3复合物，为增加该复合物的稳定性，稳定序列1通过碱基互补配对的原则结合到该复合物上来，最终oligo3、稳定序列1以及小RNA通过融合效应形成一个稳定的oligo3/稳定序列1-RNA复合物，该复合物在逆转录酶的作用下得到小RNA分子全长的cDNA，即为oligo3-RNA~cDNA：RNA复合物，此为第二次序列延伸；

（4）步骤（3）oligo3-RNA~cDNA：RNA复合物在RNaseH的作用下，复合物中的RNA会被降解，形成oligo3-RNA~cDNA；

（5）oligo4会和oligo3-RNA~cDNA互补配对结合，形成oligo3-RNA~cDNA-oligo4复合物；为增加该复合物的稳定性，稳定序列2通过碱基互补配对的原则结合到该复合物上来，最终Oligo4、稳定序列2、稳定序列1以及oligo3合成的oligo3-RNA~cDNA通过融合效应形成一个稳定的复合物，即为oligo3-RNA~cDNA-oligo4/稳定序列2复合物；该复合物在逆转录酶的作用下得到含有T7启动子序列、标签序列以及小RNA分子全长的双链DNA，即oligo3-RNA~cDNA-oligo4双链DNA，此为第三次序列延伸；

（6）在（5）中形成的oligo3-RNA~cDNA-oligo4双链DNA序列结构为T7 启动子-ZC2-ZC1-RNA~cDNA-ZC3，该双链DNA通过TMA 或 NASBA方法进行扩增，得到一段序列为ZC2-ZC1-RNA~cDNA-ZC3的RNA分子；

（7）检测所述RNA 的扩增产物的存在与否和/或数量，由此判断待检生物大分子的存在与否和/或数量。