[发明专利]产肠毒素大肠杆菌I型菌毛基因fimA的应用

说明书

本发明涉及产肠毒素大肠杆菌I型菌毛基因的应用。本发明公开了fimA序列中第71位的一段特有基序AAACTA作为监测、鉴别产肠毒素大肠杆菌的分子标记的应用。并设计一对特异性鉴定引物，可以在猪场临床环境中快速检测产肠毒素大肠杆菌。通过这对引物对分离的细菌DNA模板进行PCR扩增，如果存在产肠毒素大肠杆菌，则可以扩增预期的阳性条带；如果是其他非产肠毒素大肠杆菌病原菌，非致病大肠杆菌或引起腹泻的其他病原菌如沙门菌、魏氏梭菌等其他菌属，则结果阴性。本发明基于不同菌属I型菌毛FimA基因序列的差异性，发现在产肠毒素大肠杆菌fimA存在的特有的一段序列，设计出为临床快速区分和鉴定产肠毒素大肠杆菌提供新策略和方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。主要是用产肠毒素大肠杆菌fimA基因的独特序列位点作为分子标记，利用该序列设计一对特异性的引物，通过常规PCR扩增特征性基因片段进行检测。

背景技术

仔猪腹泻是生猪生产中最常发的疾病，导致仔猪日增重减少，脱水甚至死亡，对正常生产造成严重的影响。引起仔猪腹泻最常见的病原体包括产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，沙门菌，魏氏梭菌等细菌，以及猪传染病胃肠炎病毒(TGEV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(RV)等病毒。其中病原菌产肠毒素大肠杆菌根据其表达的菌毛类型可以进一步分类为K88⁺ETEC，F18⁺ETEC，987P⁺ETEC，F41⁺ETEC，K99⁺ETEC等不同血清型。目前临床上对猪场新发仔猪腹泻疾病的诊断主要是：(方法1)通过不同病原体的抗(体)血清进行玻板或者试管凝集实验确认阳性。因此，在确定细菌引发的腹泻时，需要使用针对不同大肠杆菌K88，K99，F18，987P，F41菌毛抗血清，不同沙门菌鞭毛或O抗原单因子抗血清，以及魏氏梭菌鉴定方法分别进行检测，直到获得阳性反应结果，上述凝集反应的敏感性不高，特异性也存在有一定程度局限性，常常存在假阳性；(方法2)通过实验室对肠道、粪便样品进行培养和划线分离，通过生化试验确定菌属后(通常培养需要一天)，再通过血清凝集或者针对不同抗原血清型的引物进行PCR确定具体病原菌血清型，过程繁琐，耗时耗力。值得注意的是，在鉴定过程中，标准株和临床分离株通常都需要筛选特殊的培养基并需要在实验室连续培养传代并在适宜的环境下(如温度、pH值等)，其用于血清学检查的外膜抗原表达较为充分，而未经上述方法处理的菌株其粘附素在体外培养条件下不能达到一定程度的表达，因而采用单因子血清进行玻板或试管凝集试验检测，不能产生肉眼可见的凝集反应，基于检测菌毛的玻板或试管凝集试验和应用受到很大限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的PCR特异性检测方法，可以对临床环境样本进行快速鉴别是否为产肠毒素大肠杆菌。

本发明的技术方案：从已知的基因序列信息和比较分析表明，产肠毒素大肠杆菌的fimA序列较其他菌属相对保守，并且猪源产肠毒素大肠杆菌的fimA序列较非致病性大肠杆菌或其他致病性大肠杆菌在其第71个碱基处存在特有的6个碱基(连续插入“AAACTA”)。鉴于基因fimA以上特征，在大肠杆菌基因fimA设计上下游引物，其中上游引物3’端序列为AAACTA。根据PCR原理，引物3’端如果不能有效配对模板序列，则不能发生有效匹配扩增。该设计上游引物末端序列仅在猪产肠毒素大肠杆菌fimA序列71个碱基处出现，其他血清型大肠杆菌或其他菌属fimA基因均不存在。因此，通过制备各种待检细菌的DNA模板用于PCR检测，当模板可以特异性扩增预期294bp大小的条带时，说明并明确该待检菌株为产肠毒素大肠杆菌；当模板不能扩增相应条带，则该待检菌株不是产肠毒素大肠杆菌。

本发明公开了I型菌毛fimA基因第71位插入特征序列“AAACTA”作为监测、鉴别产肠毒素大肠杆菌的分子标记的应用。

本发明还公开了用于检测仔猪腹泻致病性大肠杆菌的特异性引物，其特征是一段引物的3’端末端序列为AAACTA，一个具体的实例，序列如下：