[发明专利]基于RPA技术检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的试剂盒及其专用引物和探针

说明书

本发明公开了基于RPA技术检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的试剂盒及其专用引物和探针，所述专用引物的正向引物序列为CGACAGCACGTTGAACTCTAGGTTACCGACAC，反向引物序列为AGCCGTTCTACCTCCTGGGCGTTACTTCCCTC，探针序列为CATCTGATTTCTTTGTCAACCCAAGTTCAGAAT(BHQ1‑dt)c(THF)g(FAM‑dT)GTTAGTGCGGCCATATC(C3spacer)；采用包括上述引物和探针的试剂盒可以快速且成功检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的检测技术，具体涉及基于RPA技术检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的试剂盒及其专用引物和探针。

背景技术

草鱼病毒性出血病(Grass carp hemorrhagic disease)是严重危害草鱼养殖业的一大疾病，其病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属。GCRV为20面体的球形颗粒，病毒直径70～80nm，具有双链RNA结构，根据VP6基因序列比较，可将GCRV分为三种类型：GCRVⅠ型(代表株GCRV-873)，GCRVⅡ型(代表株GCRV-HZ08)，GCRVⅢ型(代表株GCRV-104)。GCRV感染草鱼可引起其内脏、鳃和体表广泛性出血，可使处于鱼种阶段的草鱼死亡率高达90％以上。

已有的GCRV检测技术如常规的RT-PCR技术耗时，灵敏性和特异性较低，样品容易污染，而且需要昂贵的仪器，限制其大规模应用；RT-LAMP技术其引物设计繁琐，又因其极其灵敏，检测过程中容易出现假阳性，难辨别，不适用于水产养殖基层诊断人员使用。因此急需建立一种快速简便的草鱼呼肠孤病毒现场检测方法。

近年来，恒温核酸扩增技术得到快速发展，解决PCR技术的局限，在短时间内可以得到准确的检测结果，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-meraseamplification，RPA)是恒温核酸扩增技术的一种，该技术主要利用能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶这三种酶，在37-42℃等温条件下，反应10-40分钟即可得到扩增产物。RPA技术可与荧光定量PCR技术(Real-timePCR)结合可以实现对草鱼呼肠孤病毒的快速检测。

发明内容

为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供基于RPA技术检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的试剂盒及其专用引物和探针，基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepoly-merase amplification，RPA)与实时定量PCR技术(Real-Time PCR)结合，实现Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的快速检测。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

基于RPA技术检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的专用引物，是根据Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒目的基因设计的，所述Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的目的基因序列为：

cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt；且所述专用引物的正向引物序列为CGACAGCACGTTGAACTCTAGGTTACCGACAC；所述专用引物的反向引物序列为AGCCGTTCTACCTCCTGGGCGTTACTTCCCTC。

本发明的第二方面，基于RPA技术检测Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的探针，是根据Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒目的基因设计的，所述Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒目的基因序列为：