[发明专利]一种鉴别条斑紫菜中是否夹杂坛紫菜的方法

说明书

本发明公开了一种鉴别条斑紫菜中是否夹杂坛紫菜的方法，开发特异引物序列PorF和PorR，将待检测样品与条斑紫菜中混入1%坛紫菜的标准品均利用CTAB法提取DNA，利用提取DNA进行荧光定量PCR反应检测坛紫菜成分的有无和相对百分含量；与现有技术相比，本发明简单快速，取样量少，结果稳定可靠，在检测目的坛紫菜成分有无的基础上，一定程度反映了样品中坛紫菜成分含量。

技术领域

本发明属于涉及一种鉴别条斑紫菜中是否夹杂坛紫菜的方法，属水产品质量安全技术领域。

背景技术

条斑紫菜和坛紫菜同属紫菜属，在外观上比较相似，经加工后更是无法肉眼区分，普通感官判断方法无法鉴定。即食海苔是以条斑紫菜为主要原料，添加或不添加食品添加剂及其它原料，经烘烤等工艺制成的可直接食用的食品。海苔产品含有丰富的钙、钾、碘、铁、锌等矿物质、维生素、蛋白质和膳食纤维，口感香脆，入口即化，味道鲜美，绿色无污染的特性满足了现代消费者营养和口感需求，深受消费者喜欢。而坛紫菜由于其藻体厚、胶质多，通常是通过简易的烘干设备制成价格低廉的大散菜、菜饼；目前市场上偶有出现在条斑紫菜中掺杂坛紫菜进行加工成高价海苔的现象，扰乱了市场秩序，破坏了商业诚信，损害了消费者利益。

鉴于此种情况，快速、准确的鉴别条斑紫菜中是否夹杂坛紫菜是十分必要的。线粒体DNA序列常用于物种的鉴定，但条斑紫菜和坛紫菜亲缘关系较近，两者基因组DNA序列差异很少，通用的DNA条形码-细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI)的片段无法把两者区分。

发明内容

针对市售即食海苔（条斑紫菜）中掺入价值较低的坛紫菜的问题，本发明通过分析条斑紫菜和坛紫菜线粒体序列差异，设计特异扩增坛紫菜引物序列，以条斑紫菜中混合1%的坛紫菜为标准样品，提取标准样品和混合样品DNA，进行荧光PCR扩增，检测待检样品中坛紫菜的有无及相对含量，建立市售即食海苔（条斑紫菜）中坛紫菜的鉴别技术。

这种鉴别条斑紫菜中是否夹杂坛紫菜的方法，采取的技术方案是：

将待检测样品与条斑紫菜中混入1%坛紫菜的标准品均利用CTAB法提取DNA，利用提取DNA进行荧光定量PCR反应检测坛紫菜成分的有无和相对百分含量；包括特异引物的开发和荧光定量PCR体系的建立，所述特异引物为PorF: 5’-TTC CAG GAA GGT TTT AGA ACC T-3’， PorR: 5’-GAC AAA ACA GCC TAG TTT TTG C-3’；引物来自于坛紫菜线粒体序列，可以特异扩增坛紫菜序列，但不能扩增条斑紫菜序列。

进一步地，所述特异引物的序列是将坛紫菜和条斑紫菜线粒体序列从NCBI 下载，经过比对分析，找出序列差异位点，在坛紫菜线粒体序列（JQ736808.1）10104-10224位置之间121bp片段设计引物。

进一步地，荧光定量PCR所用引物为所述特异引物PorF和PorR，内参序列为UBCF-TCA CAA CGA GGA TTT ACC ACC；UBCR-GAG GAG CAC CTT GGA AAC G；实验所用荧光定量SYBR GreenⅠ PCR体系：SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix (2×) Universal5.2μl，PrimerF (10μM) 0.4μl，Primer R (10μM) 0.4μl，DNA 1μl，H2O 补齐至10μl；实验所用PCR扩增程序：95℃ 3min，95℃ 3s，60℃ 20s，40个循环；溶解曲线程序：95℃ 15s，60℃15s，95℃15s。

进一步地，数据分析采用相对定量常用－ΔΔCT法，以1%标准品为参照；未知检测样品中坛紫菜含量百分数＝2－ΔΔCT *1%；ΔΔCT＝（CT靶基因Por－CT内参UBC）检测样品－（CT靶基因Por－CT内参UBC）1%标准样品。

本发明的特点在于：

1、以坛紫菜和条斑紫菜线线粒体差异序列为基础设计引物，引物扩增结果稳定可靠。