[发明专利]一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒，属于微生物诊断技术领域。本发明提供的基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物对和探针是以羊布鲁氏菌pb26基因序列的特异性保守区域为模板设计得到。将本发明提供的试剂盒利用重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的pb26基因时，检测灵敏度达到6CFU。同时本发明提供的引物对检测布鲁氏菌具有较强的特异性。

技术领域

本发明属于微生物诊断技术领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌，广泛感染家畜、野生动物和人，家畜动物布鲁氏菌主要感染羊、牛和猪，其中对人致病的主要有马耳他布鲁氏菌和流产布鲁氏菌；布鲁氏菌病感染家畜引起公畜的附睾炎和怀孕家畜的流产、胎盘炎症和不育；对于人类，布鲁氏菌病可引起急性炎症和许多类似流感感染的症状，包括波浪热、多汗、背疼和体质虚弱。在一些病人身上，急性临床症状可持续一年以上，最终导致慢性的持续性感染。慢性临床症状包括不规则的发热、关节疼、乏力，并发引起关节炎、局部末梢神经炎症、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎。布鲁氏菌病的流行不仅危害畜牧业的发展，造成巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的健康和公共卫生安全。

当前，对于动物布鲁氏菌病原学的诊断技术有涂片染色、镜检，随着分子生物学技术的发展，PCR技术逐步成为布鲁氏菌检测的重要手段。PCR研究方法很多，可以归纳为单对引物PCR、多重PCR、实时PCR等。单对引物PCR较早用于布鲁氏菌属的检测，检测所使用的扩增模板和手段很多，常选用的有16SrRNA、IS711、VirB8、bcsp31、外膜蛋白omp2b、omp2a、omp31和omp25等。Imaoka等以bcsp31基因和三种外膜蛋白基因(omp2b，omp2a，omp31)为靶基因，设计4对引物进行PCR反应，对羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌及犬种布鲁氏菌进行了检测。Ouahrani-Bettache等人根据IS6501在不同种及生物型布鲁氏菌基因中的位置及数目不同，设计了IS6501锚定PCR，该方法不仅可以区分不同的布鲁氏菌种，而且可以区分野毒株和A19疫苗株，对于流行病学调查有着非常重要的意义。Bricker等建立了AMOS(abortus melitensis ovis suis)PCR，是最早建立的多重PCR方法。该试验可以鉴别牛种1、2和4型，羊种1、2、3型，绵羊副睾种和猪种1型布鲁氏菌。后来Ewalt等两次改进了AMOS PCR，使该法可以鉴别的菌种类型进一步完善。国内钟旗等应用AMOS PCR开展了布鲁氏菌种型鉴定研究，结果表明该方法的特异性、敏感性均高于细菌分离和血清学诊断方法，且能区分各种和部分生物型。实时(Real-time)PCR是新近发展的分子生物学技术，其最突出特点是快速、无需电泳并能避免污染。Redkar等于2000年应用Real-time PCR鉴别了牛种、羊种、猪种布鲁氏菌3个种。刘志国等建立的基于TaqMan探针的多重实时荧光PCR方法能快速检测布鲁氏菌的同时并可以确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。PCR技术除了可以应用于布鲁氏菌种属的区分鉴别以外，还可以根据某些特定的序列描述新种和菌株特征。除了PCR技术之外，还有核酸探针技术、环介导等温扩增技术(LAMP)被应用于动物布鲁氏菌的诊断。然而，上述技术的应用都只能在实验室内进行，无法做到临床快速诊断。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和检测试剂盒，使所述引物、探针和检测试剂盒实现临床上达到快速诊断的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的探针，具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。