[发明专利]pORF65重组蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了pORF65重组蛋白及其制备方法和应用，所述pORF65重组蛋白依次由SEQ ID NO.17—SEQ ID NO.21所示氨基酸序列通过连接子连接而成，所述连接子为4－7个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。经ELISA显示，本发明所述pORF65重组蛋白可以作为包被抗原，能很好地用以检测CyHV‑3 pORF65完整编码序列构建的DNA疫苗免疫锦鲤后产生的血清特异性抗体，以及诊断锦鲤是否感染鲤疱疹病毒3型。

技术领域

本发明涉及抗原抗体领域，具体是涉及pORF65重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(KHV)，是一种双链线性DNA病毒，具有囊膜结构，自上世纪九十年代报道以来已经在世界范围内流行，该病毒引起的锦鲤疱疹病毒病(KHVD)造成巨大经济损失，严重威胁鲤、锦鲤产业安全。在CyHV-3防治研究中基于病毒囊膜蛋白的DNA疫苗成为重要的研究方向，病毒囊膜蛋白参与了病毒与宿主细胞的识别、互作、侵染等过程，可以诱导较强的体液免疫应答，是DNA疫苗研发的重要候选分子。为准确评价DNA疫苗免疫效果、制定免疫方案，需要建立高通量、特异性抗体检测方法作为CyHV-3疫苗研究的技术支撑。因此表达CyHV-3囊膜蛋白抗原与制备抗鲤血清IgM的抗体成为建立检测方法亟待解决的关键问题。

鱼类免疫球蛋白纯化及其单抗、多抗制备是免疫评价、诊断方法建立的基础。Protein A G作为抗体结合蛋白在抗体纯化中得到广泛应用。尽管鲤是一种重要的经济鱼类，但其血清IgM纯化仅见凝胶过滤层析制备的报道，亲和层析作为一种快速制备高纯度抗体的方法尚未应用于鲤血清IgM的纯化。

因此，本发明在密码子优化与预测CyHV-3 pORF65 B细胞表位优势区段的基础上，采用pET32a(+)/BL21系统重组表达pORF65 B细胞表位优势区段；采用rProtein G亲和层析纯化了鲤血清IgM，并制备了鼠抗鲤IgM多克隆抗体；在此基础上初步建立了CyHV-3特异性抗体检测的间接ELISA方法，为进一步开展CyHV-3疫苗研究提供基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供新的pORF65重组蛋白，其可以用于检测CyHV-3 pORF65完整编码序列构建的DNA疫苗免疫锦鲤后产生的血清特异性抗体。

实现上述目的的技术方案如下。

pORF65重组蛋白，其依次由SEQ ID NO.17—SEQ ID NO.21所示氨基酸序列通过连接子连接而成，所述连接子为4－7个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。

所述连接子组成为GGGGS。

一种编码上述pORF65重组蛋白的表达基因，其序列，包括a：其核苷酸序列如SEQID NO.22所示；b：与a的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列；C:对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

上述pORF65重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

包含上述编码所述pORF65重组蛋白的表达基因序列通过HindIII/XhoI双酶切插入pET32a(+)载体，构建重组质粒pET32a-mod ORF65；

再转入DH5α，PCR筛选阳性转化菌株，阳性菌株测序鉴定后提取质粒，分别转入BL21(DE3)表达菌株；

挑取转化pET32a-mod ORF65的BL21(DE3)表达菌株，接种于Amp抗性的LB培养基中培养过夜，再接种于LB新鲜培养基中，再加入IPTG诱导表达、纯化，即得。

编码所述pORF65重组蛋白的表达基因的序列如SEQ ID NO.22。