[发明专利]一种用于鉴定中药麝香的PCR方法

权利要求书

1.一种用于鉴定中药麝香的PCR方法，包括如下步骤：

（a）从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

所述引物对为由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对；

（b）对步骤（a）所得PCR产物进行测序，获得测序序列；

（c）按照如下（c1）或（c2）确定所述待测中药样品是否为麝香：

（c1）将所述测序序列与标准序列进行比较，如果所述测序序列与所述标准序列完全一致，则所述待测中药样品为或候选为麝香；反之，则所述待测中药样品不为或候选不为麝香；

（c2）以所述测序序列和所述标准序列为数据源，基于K2P 距离模型构建NJ树，如果所述测序序列与所述标准序列在NJ树的同一个分枝上，则所述待测中药样品为或候选为麝香；反之，则所述待测中药样品不为或候选不为麝香；

所述标准序列选自如下任一：SEQ ID No.3所示核苷酸序列、SEQ ID No.4所示核苷酸序列、SEQ ID No.5所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（a）中，从所述待测中药样品中提取基因组DNA是按照包括如下步骤的方法进行的：采用60-70%乙醇对所述待测中药样品中的组织碎片和DNA进行沉淀，然后采用CTAB法提取基因组DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：从所述待测中药样品中提取基因组DNA是按照包括如下步骤的方法进行的：

（a1）将所述待测中药样品置于60-70%乙醇中旋涡振荡10-20min，65℃孵育20-60min，离心得沉淀，记为沉淀1；

（a2）将所述沉淀1置于CTAB提取液中，65℃孵育20-60min；然后加入由氯仿和异戊醇按照体积比24：1的比例混合而成的混合液，振荡，离心得上清，记为上清1；

（a3）向所述上清1中加入由氯仿和异戊醇按照体积比24：1的比例混合而成的混合液，振荡，离心得上清，记为上清2；

（a4）向所述上清2中加入异丙醇，-15至-25℃放置1-3h；然后离心得沉淀，记为沉淀2；

（a5）将所述沉淀2用乙醇漂洗后，得所述基因组DNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（a）中，采用所述引物对进行PCR扩增时的退火温度为56℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（b）中，对所述PCR产物进行测序后，还包括如下步骤：对测序所得原始序列进行预处理，去除两端的低质量区域和引物区，获得132 bp的测序序列。

6.用于鉴定中药麝香的引物对，其特征在于：所述引物对为由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对。

7.用于鉴定中药麝香的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求6所述引物对、dNTP和DNA聚合酶。

8.权利要求6所述的引物对或权利要求7所述试剂盒在鉴定中药麝香中的应用。

9.一种鉴定待测中药麝香的基源动物的方法，包括如下步骤：

（A）从待测中药麝香中提取基因组DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

所述引物对为由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对；

（B）对步骤（A）所得PCR产物进行测序，获得测序序列；

（C）按照如下（C1）或（C2）确定所述待测中药麝香的基源动物：

（C1）将所述测序序列与三个标准序列进行比较，所述测序序列与所述三个标准序列中的哪一个相比完全一致，则所述待测中药麝香的基源动物为或候选为该标准序列所对应的物种；

（C2）以所述测序序列和所述三个标准序列为数据源，基于K2P 距离模型构建NJ树，所述测序序列与所述三个标准序列中的哪一个在NJ树的同一个分枝上，则所述待测中药麝香的基源动物为或候选为该标准序列所对应的物种；

所述三个标准序列为：对应马麝的SEQ ID No.3所示核苷酸序列；对应林麝的SEQ IDNo.4所示核苷酸序列；对应原麝的SEQ ID No.5所示核苷酸序列。