[发明专利]一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂

权利要求书

1.一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其特征在于：所述曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂的制备方法包括：

预处理：选取性成熟、活力较强的曼氏无针乌贼个体置于冰上，低温条件下取乌贼脑组织，将乌贼脑组织置于冷冻液中，并于-80～-100℃超低温冷冻保存；将解冻后的乌贼脑组织放入离心管中，每50-60只乌贼脑组织加入20-25mL 1.0‰三氟乙酸水溶液，高速匀浆5-6min，2-4℃、15000-18000r/min离心25-30min，取上清液，浓缩至1/2-2/5体积后以0.45μm针头过滤器过滤，滤液在保存；

分离：将脑组织粗提液通过RP-HPLC高效液相系统进行分级分离，采用二元流动相梯度洗脱系统进行洗脱分离，分离所用流动相均超声处理，收集每min分离组分，收集组分浓缩后于-40～-55℃保存得神经肽GnRH；

复合：将神经肽GnRH与神经肽GnRH类似物在10-樟脑磺酸与金属镧存在的条件下发生反应，即得曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其特征在于：所述预处理步骤中的冷冻液为：二甲基亚砜2.0-2.05g/L、乙酰胺1.5-1.55g/L、1,2-丙二醇1.0-1.1g/L、聚乙二醇-800 0.6-0.7g/L、色甘酸钠0.1-0.12g/L、还原性谷胱甘肽0.02-0.05g/L、磷酸盐缓冲液、卵磷脂3.5-6.5g/L、苯甲酸盐1-10g/L、硝酸钠10-20g/L、丙三醇5-10g/L、青霉素200-220IU/mL、链霉素150-180IU/mL，余量为双蒸水。

3.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其特征在于：所述分离步骤中，洗脱分离时的流动相A为1‰三氟乙酸水溶液，流动相B为1‰三氟乙酸乙腈水溶液，流速为1mL/min，进样量为150μL，检测波长为238nm和214nm处，柱温为25℃。

4.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其特征在于：所述曼氏无针乌贼神经肽GnRH参与调控生殖活动的分子生物学分析步骤包括：神经肽基因克隆和序列分析、神经肽组织特异性表达分析、神经肽脑组织表达定位分析。

5.根据权利要求4所述的一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其特征在于：所述神经肽基因克隆和序列分析步骤为：使用反转录试剂盒，利用提取得到的曼氏无针乌贼脑组织总RNA合成cDNA第一条链；以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH-F和GnRH-R进行进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，经纯化、连接与克隆后得到核心片段序列；分别以曼氏无针乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3′RACE片段、5′RACE片段所需的模板cDNA后，分别经PCR扩增、切胶回收和克隆连接后得到3′端、5′端片段序列；使用Lasergene软件对GnRH基因的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼GnRH基因的cDNA全长序列。

6.根据权利要求5所述的一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其特征在于：所述曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR 73bp，前体蛋白MW为10.1kDa，等电点pI为7.73。