[发明专利]一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1.FHM细胞复苏提纯；S2.FHM细胞基础培养；S3.FHM细胞扩大培养；S4.IHNV病毒培养；S5.IHNV病毒提纯；S6.IHNV病毒灭活。该方法制备得到IHNV灭活疫苗应用于预防传染性造血器官坏死病；通过该方法可成功制得IHNV灭活疫苗，灭活效果好，灭活疫苗安全性高，相对免疫保护率高，同时该制备方法工艺简单，有利于缩减疫苗大规模生产的周期和成本，可用于工业制备IHNV灭活疫苗用于预防传染性造血器官坏死病。

技术领域

本发明涉及一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

虹鳟是一种名贵的冷水性鱼类，其肉质鲜嫩、味美，蛋白质和脂肪含量高，胆固醇含量几乎等于零，EPA含量高于其它鱼类数倍以上，具有“水中人参”的美誉，因此广受人们喜爱。我国自1959年起开始养殖虹鳟，主要品种包括硬头鳟、道纳尔逊氏超级虹鳟、Jalo品系虹鳟和金鳟（黄虹鳟）等。目前我国虹鳟养殖场400多家，分布于23个省、市、自治区的100个县内，养殖方式多为高密度流水养殖。然而，近年来由于虹鳟养殖规模逐步地扩大，苗种需求量增加，鱼卵、鱼苗流通性的增大，且高密度养殖，造成了虹鳟各种疾病频繁地发生，特别是传染性疾病，如传染性造血器官坏死病，给虹鳟的养殖带来极大经济损失，严重地制约着虹鳟养殖业的发展。

传染性造血器官坏死病（Infectious Hematopoietic Necrosis, IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV）所引起的一种鲑科鱼类急性死亡的病毒性传染病，呈现快速传播与广泛发生的特征。该病被OIE列为必须申报的动物疫病，是鱼类进出口岸第1类检疫对象。2014年我国农业部将其列为《2014年国家水生动物疫情监测计划》的重点专项监测疫病之一。自1985年IHN疫情首次在中国出现以来，IHN已经先后在黑龙江、辽宁、青海、北京、甘肃、吉林、山东以及四川等地暴发，死亡率可高达100%，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。

IHNV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus）。其外形为子弹状，含二十面立体对称型核衣壳，长150 nm-190 nm，直径65 nm-75nm，为单股负链RNA病毒。IHNV含有脂蛋白包膜，表面有纤细的刺突，与狂犬病毒的蛋白结构类似，能在多种细胞系上生长，包括大鳞大马哈鱼胚细胞系(Chinook salmon embryo, CHSE-14)、鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulossum of carp, EPC)、肥头鲦鱼细胞(Fatheadminnow, FHM)、虹鳟性腺细胞系(Rainbow trout gonad, RTG-2)、蓝鳃太阳鱼成纤维细胞系(Bluegill fry, BF-2)等。该病毒的增殖温度范围为4℃-20℃，其最适增殖温度为15℃，细胞病变主要表现为细胞变圆，细胞脱落，出现空斑且空斑边缘细胞牵拉，成葡萄状。

IHNV的易感对象主要为鲑、鳟鱼类的鱼苗或者幼鱼；IHNV敏感的宿主包括大麻哈鱼属的红大麻哈鱼、虹鳟、大鳞大麻哈鱼、细磷大麻哈鱼、大麻哈鱼、马苏大麻哈鱼、克氏鲑和玫瑰大麻哈鱼。成鱼感染通常不会出现死亡，而是成为病毒的传染宿主。当幼鱼和鱼苗感染后，其临床症状表现为眼球突出，鳃丝苍白，鳍条基部充血，体色发黑，腹部膨大，肛门处常拖着一条黄色的粘液粪便，解剖可见肝苍白，肾脏常呈现花斑状，胃、肠内有大量微黄、浑浊的粘液。幼鱼也常常变现出一些神经症状，包括打转，痉挛，时在剧烈抽搐后死亡。

现有养殖场等一般对感染IHN的病鱼采取的措施是全部销毁，并对养殖场地和设备进行全面消毒；但是此种方法不能从根源上有效降低虹鳟等感染IHN的发病率。同时现有IHNV病毒灭活疫苗的制备成本高，工艺复杂，灭活时间长，同时疫苗的灭活效果不佳，导致IHNV病毒灭活疫苗制备效率不高。

发明内容