[发明专利]一种基因甲基化的检测方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因甲基化的检测方法。本发明检测方法是采用限制性内切酶处理待检测核酸，并针对待检区域核酸序列设计特异性的引物探针，进行PCR扩增和荧光信号检测。本发明具有操作简单，特异性强，灵敏度高的优势。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因甲基化的检测方法。

背景技术

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。

DNA甲基化通常抑制基因表达，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。因此，研究基因的甲基化对癌症的早期筛查具有非常重要的意义。

目前，基因甲基化的检测主要是通过亚硫酸氢盐处理，再以甲基化特异性的PCR或测序的方法进行区分，该类方法容易发生亚硫酸氢盐转化不完全而导致的假阳性结果，且操作步骤繁琐，所需试剂种类多，耗时长。

发明内容

针对现技术存在的问题，本发明提供一种基因甲基化的检测方法，目的是通过采用限制性内切酶结合实时荧光定量PCR，实现操作简单、特异性强、灵敏度高的基因甲基化检测。

实现本发明目的的基因甲基化检测方法按照以下步骤进行：

(1)采用限制性内切酶反应液中的限制性内切酶处理待测样本核酸DNA，得到酶切产物；

(2)向检测引物探针中加入酶切产物，形成的qPCR反应液，进行qPCR扩增；

(3)根据qPCR结果进行FAN荧光通道检测，若被检样本FAM荧光通道有扩增，则为阳性样本，说明目的基因发生甲基化，若FAM荧光通道没有扩增，则为阴性样本，说明目的基因没有甲基化。

其中，所述的待测样本包括：人类的全血样本、血浆样本、FFPE样本、唾液样本、尿液样本、粪便样本以及植物和微生物。

所述的限制性内切酶反应液，具体组分包括：10-100U限制性内切酶，5μL 10×限制性内切酶酶切缓冲液。

所述的限制性内切酶为第二型限制性内切酶中的一种或两种以上，根据目的基因进行选择，具体包括：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。

所述的处理处理待测样本核酸DNA时间为1～16小时。

所述的检测引物探针包括：目的基因引物对和探针；内参基因引物对和探针。

所述的qPCR反应液，具体组分包括：0.1-1μM目的基因引物对，0.1-1μM目的基因探针，0.1-1μM内参基因引物对，0.1-1μM内参基因探针，2×qPCR Master Mix。

所述的qPCR平台包括：Roche、ABI、Bio-Rad、Agilent、杭州博日科技有限公司(BIOER)。

所述的FAN荧光通道检测的检测限为：样本DNA含量≥2ng、甲基化突变频率低≥1％