[发明专利]一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒。

背景技术

禽流感(Avian influenza)是由A型流感病毒引起的一种人与动物共患病，不仅引起禽类以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病，而且可导致人的感染和死亡，严重威胁人类健康。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)最显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁，按病原体类型的不同，可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报疾病。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种明录》将其列为一类动物疫病。

检测禽流感的技术有酶联免疫(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)，目前比较主流的是PCR检测技术。PCR又分为普通PCR和荧光定量PCR两种，与普通PCR相比，荧光定量PCR操作简单、特异性更强、自动化程度更高。

禽流感因为亚型比较多，一般的禽流感病毒H5、H7、H9都需要检测，所以建立一种禽流感H5、H7、H9三重荧光定量PCR试剂盒很有必要。

然而一般的荧光定量检测前需要提取样本中的核酸，这就无形中增加了检测成本，降低了检测效率。因此，建立一种免核酸提取的禽流感H5、H7、H9三重荧光定量PCR试剂盒检测技术，具有重要的现实意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为检测禽流感病毒提供良好的基础。

本发明的第二目的在于提供一种禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，为检测的进行提供便利。

本发明的第三目的在于提供一种禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法，采用免核酸提取进行禽流感病毒的荧光定量PCR检测，节约检测成本，节约人力，并且三种亚型的病毒可以同时检测，根据探针5′端标记荧光报告基团的不同判断阴性和阳性，提高检测效率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；

第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；

第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；

第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为定量检测禽流感病毒提供良好的基础。

其中，第一引物对对应检测禽流感病毒H5亚型，第二引物对对应检测禽流感病毒H7亚型，第三引物对对应检测禽流感病毒H9亚型。

进一步地，所述探针为自身淬灭探针。

进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种。

进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。

进一步地，所述核酸序列至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。

由于不同的引物对及其相应的探针用于检测不同的禽流感病毒亚型，通过设置不同的探针5′端标记荧光报告基团，不同荧光报告基团在进行实时荧光定量检测时，吸收峰不同，据此，可同时检测不同的禽流感病毒亚型。

经试验发现，不同的引物对对应的探针的报告基因具有偏好性，即不同探针采用特定的报告基团检测效果更佳。

进一步地，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团FAM；

所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团Hex；

所述第三引物对对应的第三探针的5′端标记荧光报告基团VIC。

优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。

本发明还提供了禽流感病毒的检测试剂盒，包括上述的核酸序列，即为上述引物对及其对应的探针中的一种或多种。

本发明提供的禽流感病毒的检测试剂盒，为检测的进行提供便利。

进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。

进一步地，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；