[发明专利]一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；

第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；

第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；

第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针；

进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团；

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种；

进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。

3.根据权利要求1-2任一项所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。

4.根据权利要求3所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团FAM；

所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团Hex；

所述第三引物对对应的第三探针的5′端标记荧光报告基团VIC；

优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。

5.禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的核酸序列；

进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。

6.根据权利要求5所述的禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；

优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-1000.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-1000.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

7.禽流感病毒的检测方法，其特征在于，待检测病毒的核酸以权利要求1-4任一项所述的核酸序列进行实时荧光定量PCR检测；

进一步地，所述待检测病毒的核酸通过以下步骤制备：

取待检测物，加入裂解液，振荡，然后加入中和液，混匀，离心，得到的上清液即为所述待检测病毒的核酸；

所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

8.根据权利要求7所述的禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述裂解液与所述中和液的添加比例为1:1±0.1；

进一步地，所述待检测物包括禽类咽喉腔拭子采集物、泄殖腔拭子采集物、血液、血清、血浆、组织。

9.根据权利要求7或8所述的禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述待检测物采用权利要求3-4任一项所述的核酸序列同时实时荧光PCR检测；

进一步地，所述实时荧光定量PCR检测的反应条件：

第一步：42℃保持15-20min；

第二步：94±1℃保持2-5min；

第三步：94±1℃保持10-15s，60℃保持28-35s，40±2个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

10.根据权利要求9所述的禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述第一引物对对应检测禽流感病毒H5亚型，所述第二引物对对应检测禽流感病毒H7亚型，所述第三引物对对应检测禽流感病毒H9亚型，检测结果均采用以下方法判定：

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线；

阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线；

待检测物CT值<30并有明显的扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值>37并无扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值介于30和37之间则判为可疑，需重复检测，若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。