[发明专利]人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法

说明书

本发明提供一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，先采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液。接下来设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底。最终使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60‑65℃，时长1min，重复30‑60个循环，于60‑65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。如此，有效缩短了检测时间。

技术领域

本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法。

背景技术

肠道病毒71型为小RNA病毒科，肠道病毒属。1974年首次报道从美国具有中枢神经系统症状患者标本中分离到EV71，此后EV71的流行范围遍及全球。目前，人类是EV71唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播，可经过被感染者的口鼻分泌物、粪便和飞沫等传播。人群对EV71普遍易感，以婴幼儿和低龄儿童感染为主。该病流行期间，可发生幼儿园集体感染和家庭聚集发病现象，而且传染性强、传播速度快、传播途径复杂，短时间内可造成较大范围的流行，疫情控制难度大。因此，快速特异的检测方法尤为重要，特别是对EV71感染引起的重症病例的检测。

对于EV71，目前的实验室检测方法主要包括细胞培养进行病毒分离、血清学抗体、RT-PCR、ReaL-time PCR等。但上述方法均存在不足：细胞培养繁杂耗时,血清学检测时肠道病毒的抗原交叉反应等问题,不适合早期应急诊断；RT-PCR技术是目前最为快速有效的检测方法之一,但其检测时间仍需6-7h,扩增后还需电泳进行特异条带比对,无法做到简便快速；ReaL-time PCR从敏感性、特异性与速度上都具有一定优势,但是检测成本较高,不太适用于临床标本检测。

鉴于以上原因，需要提供一种耗时短、成本低且准确率高的核酸检测方法，用于人类肠道病毒71型感染的辅助诊断。

发明内容

本发明提供一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法。

为更好的帮助理解本发明，下面对相关概念作出阐述。

环介导等温扩增技术是2000年建立的一种新的核酸扩增方法。其原理是利用一种链置换DNA聚合酶和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，也可以由添加SYBRGreenI、嗅化乙啶或其它核酸染剂进行呈色后观察。但由于该技术扩增效率高，反应灵敏，通过显色反应容易导致污染，且污染不易消除。

本发明将环介导等温扩增技术与荧光PCR进行结合，扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增曲线判读结果，从而实现对样本中肠道病毒71型的测定。该检测方法较PCR荧光探针法，操作简单，反应速度快，且避免了人为观察结果造成的误差。检测试剂为预混反应液，免分装，进一步简化操作步骤并且仪器不要求进行变温循环，更适用于基层临床应用及推广。

本发明提供的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，包括步骤S1-S3。

步骤S1：采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液。

步骤S2：设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底。

步骤S3：使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60-65℃，时长1min，重复30-60个循环，于60-65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。

优选的，步骤S1分解为步骤S11-S14。