[发明专利]人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法

权利要求书

1.一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液；

S2、设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底；

S3、使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60-65℃，时长1min，重复30-60个循环，于60-65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。

2.根据权利要求1所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，步骤S1分解为以下步骤：

S11、取液态样本各100μL放置于1.5mL灭菌离心管，加入100-800μL TrizoL试剂及50-200μL氯仿，用振荡器震荡20s后静置3min，12000rpm离心1-5min；

S12、吸取上层液体转移至新的1.5mL离心管中，加入10-100μL RNA提取液，振荡混匀后8000rpm离心1min，沉淀并去除液体；

S13、加入100-400μL75％无水乙醇，振荡混匀后以8000rpm离心1min，沉淀并去除液体；

S14、将装有沉淀颗粒的离心管风干5-30min后，加入50μL DEPC H2O，移液器吹打混匀所述沉淀颗粒，得到白色的混悬液待用。

3.根据权利要求1或2所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，所述RNA提取液包含酸性二氧化硅。

4.根据权利要求2所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S11中，液态样本是由水样粪便样本混匀，或较干粪便样本加入生理盐水得到，且不足100μL时补加生理盐水重悬。

5.根据权利要求2所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S14中，将装有沉淀颗粒的离心管风干5-30min，或用开放式加热器于60℃干燥5min。

6.根据权利要求2所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S14中，白色的混悬液直接用于检测，或存于-70℃待用。

7.根据权利要求1所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S2中，反应体系对应配比为：10X IsothermaL AmpLication Buffer、2.5μL；dNTP Mix(10mM)、3-4μL；MgSO4(100mM)、0.1-2μL；FIP/BIP Primers(20μM)、0.5-2.5/0.5-2.5μL；F3/B3 Primers(10μM)、0.1-1/0.1-1μL；LF/LB Primers(10μM)、0.1-1/0.1-1μL；Bst2.0 Warmstart DNA PoLymerase、0.1-2μL；Warmstart RTx Reverse Transcriptase、0.1-2μL；EVA Green、0.1-2μL；补充DEPC H2O至23μL。

8.根据权利要求1所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S3中，使用ABI stepone荧光定量PCR仪，且选用SYBR通道。

9.根据权利要求1所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S3中，判读结果的依据为：阳性质控呈“S”型扩增曲线，阴性质控无“S”型扩增曲线，且同一次实验两者需同时满足；若待检样本呈“S”型或不完全“S”型扩增曲线，则判样本为EV71阳性；若待检样本无“S”型扩增曲线，则判样本为EV71阴性。