[发明专利]外来体相关核酸的测序和分析

说明书

本发明提供了一系列步骤，其制备从细胞外囊泡分离出来的核酸(RNA和/或DNA)，以供测序。这使得各种各样的RNAs和/或DNAs能够被有效地检测到。然后可以使用这些来识别各种属性，例如基因表达、可变剪接以及检测体细胞突变和生殖系突变，包括单核苷酸变体(SNV)和结构变化(插入/缺失、融合、倒置)。

相关申请

本申请要求2016年10月21日提交的美国临时申请号62/410,974和2017年7月25日提交的美国临时申请号62/536,545的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地说，本发明属于分子诊断学技术领域。在分子生物学中，以核酸形式存在的分子，例如RNA和DNA，可以从人体样品材料(如组织和各种生物流体)中分离出来，并通过多种方法进一步分析。

背景

来自生物流体的外来体和其它细胞外囊泡的全面核酸测序，包括RNA测序，有望进行极为敏感的诊断，从而检测疾病，患者分层和监测治疗反应。术语外来体在此用于描述由细胞释放的任何细胞外膜结合的囊泡。

对于从体外或离体系统分离的外来体内的长RNA载荷，人们基本缺乏了解。以往的调查外来体RNA载荷的研究主要集中在小RNA部分。这些研究中报道的带注释的长RNAs的比例相对较小，转录覆盖率较低，这使得许多人得出结论，认为外来体只携带蛋白编码和非编码RNA的短片段，并对关于其通过外来体调节基因表达和细胞间通讯的潜在功能能力提出了疑问。

目前从细胞外囊泡中分离DNA和/或DNA及核酸(包括至少RNA)的方法包括超速离心、超滤(例如使用100 kDa滤器)、聚合物沉淀技术和/或基于大小的过滤。然而，对替代方法存在需要，所述替代方法高效和有效分离细胞外囊泡，并任选地提取其中所含的核酸，优选细胞外囊泡RNA，以及对其中所含的核酸进行测序，以用于各种应用，包括诊断目的。

因此，对细胞外囊泡内的核酸进行可靠测序和分析仍存在需要。本公开内容涉及这些和其它重要目的。

发明概述

本发明提供了对来自生物样品的核酸测序的方法，包括提供生物样品；在足以在捕获表面上或在捕获表面内保留无细胞DNA和细胞外囊泡的条件下，使生物样品与固体捕获表面接触；当无细胞DNA和细胞外囊泡在捕获表面上或在捕获表面内时，使捕获表面与溶解试剂接触，从而从捕获表面释放DNA和RNA并产生匀浆；从匀浆中提取DNA、RNA或两者；选择性地从匀浆或从提取的DNA、提取的RNA或两者中除去核糖体DNA或RNA序列；将RNA反转录成cDNA；从提取的DNA、反转录的cDNA或提取的DNA和反转录的cDNA两者构建双链DNA库；任选地扩增来自库的DNA、RNA或DNA和RNA两者；从cDNA或双链DNA库中选择性地富集核酸序列；和对包含cDNA、双链DNA或cDNA和双链DNA两者的库进行测序。

在某些实施方案中，该方法还包括在有选择地除去核糖体DNA或RNA序列之前或之后，用DNase，例如DNase I和/或修饰的DNase I对匀浆、提取的RNA或提取的DNA和RNA进行预处理的步骤。在其它实施方案中，该方法还包括在库构建过程中的任意一步，从RNA、cDNA、双链DNA选择性地除去核糖体DNA或RNA序列。

在某些实施方案中，该方法包括同时对来自生物样品的RNA和DNA进行测序。