[发明专利]外来体相关核酸的测序和分析

权利要求书

1.一种对来自生物样品的核酸进行测序的方法，其包括：

(a) 提供生物样品；

(b) 在足以将来自生物样品的无细胞DNA和细胞外囊泡保留在捕获表面上或在捕获表面内的条件下，使生物样品与固体捕获表面接触；

(c) 当无细胞DNA和细胞外囊泡在捕获表面上或在捕获表面内时，使捕获表面与溶解试剂接触，从而从捕获表面释放DNA和RNA并产生匀浆；

(d) 从匀浆中提取DNA、RNA或两者；

(e) 选择性地从匀浆或从提取的DNA、提取的RNA或两者中除去核糖体DNA或RNA序列；

(f) 将RNA反转录成cDNA；

(g) 从提取的DNA、反转录的cDNA或提取的DNA和反转录的cDNA两者，构建双链DNA库；

(h) 任选地扩增来自库的DNA、RNA或DNA和RNA两者；

(i) 从cDNA或双链DNA库选择性地富集核酸序列；和

(j) 对包含cDNA、双链DNA或cDNA和双链DNA两者的库进行测序。

2. 权利要求1的方法，其还包括在步骤(e)之前或之后，用DNase，例如DNase I和/或修饰的DNase I，预处理匀浆、提取的RNA或提取的DNA和RNA的步骤。

3.权利要求1的方法，其还包括在步骤(e)中，在库构建过程中的任意一步，选择性地从RNA、cDNA、双链DNA除去核糖体DNA或RNA序列。

4.任一项前述权利要求的方法，其还包括在步骤(d)之前或之后，向匀浆和/或提取的DNA、提取的RNA或提取的DNA和RNA两者中添加外源RNA或DNA掺杂剂的步骤。

5.权利要求1的方法，其中步骤(j)是同时对来自生物样品的RNA和DNA两者进行测序。

6. 任一项前述权利要求的方法，其还包括在步骤(d)之前或之后，用DNase，例如DNaseI预处理匀浆的步骤，接着在匀浆中添加外源RNA掺杂剂的步骤。

7.任一项前述权利要求的方法，其还包括在步骤(d)之前或之后，将外源RNA或DNA掺杂剂以1:100、1:1000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000、1:10,000,000的稀释度添加至匀浆和/或提取的RNA、提取的DNA或提取的DNA和RNA两者中的步骤。

8. 任一项前述权利要求的方法，其中选择性地除去核糖体RNA、cDNA、双链DNA的步骤包括使用酶试剂例如RNase H或限制性内切酶消化；利用基于杂交的生物素化探针富集和链霉抗生物素结合的顺磁性珠。

9.任一项前述权利要求的方法，其中从RNA、cDNA和/或双链DNA库选择性地富集核酸序列的步骤利用基于PCR的方法、互补寡核苷酸和/或基于杂交的生物素化探针富集和链霉抗生物素结合的顺磁性珠。

10.任一项前述权利要求的方法，其中RNA、cDNA和/或双链DNA分子用独特的分子指标(独特的分子标记、独特的标识符、随机条形码)标记，这使得识别模板、重复数据删除、纠错和拷贝数计数成为可能；独特的分子指标可通过引物退火、衔接子连接和酶法来附接。

11.任一项前述权利要求的方法，其中核酸包含具有超过200个核苷酸，例如超过300个核苷酸或甚至超过500个核苷酸的长RNA。

12. 任一项前述权利要求的方法，其中生物样品含有少至约0.5 mL的体积，例如约0.5mL-约20 mL、约0.5 mL-约10 mL、约0.5 mL-约5 mL、约0.5 mL-约4 mL或甚至约0.5 mL-约2mL的体积。