[发明专利]用于澄清组织的组合物和方法

说明书

一种用于澄清组织以进行后续三维分析的组合物和方法。澄清组合物包含：(1)均质剂，例如N‑甲基葡糖胺、尿素或乙二胺；(2)细胞质、水溶性折射率调节剂，如碘海醇、硫代硫酸钠或聚乙二醇；(3)膜、脂溶性RI调节剂，如2,2'‑硫代二乙醇(TDE)或丙二醇。所述组织澄清组合物特别适用于长期固定的人体组织。

发明领域

所公开的发明一般地属于组织澄清领域，并且特别是属于使用组织澄清组合物以使生物组织透明的生物组织分析领域。

发明背景

虽然生物标本本质上是三维的，但是光散射的模糊效应妨碍了高分辨率深部组织成像。可视化厚组织的一种方法是通过将它们连续切割成薄切片并使用这些切片用计算方法重建三维图像。然而，这种方法不仅费力，而且在由薄切片无法确定组织的真实三维性质的情况下也受到限制。研究具有大突起的复杂细胞，例如神经系统和病理组织中的精细结构的那些，最好在完整组织中进行。

为了保持组织的真实三维结构，人们对开发组织澄清剂和技术的兴趣激增。组织澄清技术直接使组织透明，允许在组织深处成像。通过使用能够对选择的深度平面成像(即，对组织进行光学切片)的显微镜，可以快速获取3D图像，在连续切片方法中没有切割伪像或样品破坏。良好的光学澄清方法通过减轻原位光散射同时保持组织完整性以便精确地重建信号来促进深层组织生物成像。

组织澄清技术通常改变组织的物理化学性质。目前可用于澄清组织的组合物可能引起导致结构变形的显著的膨胀。在某些情况下，澄清剂仅适用于非常小的样品，因为它们的澄清功效有限。现有的澄清剂也需要很长时间来澄清组织，并且在光学澄清之前需要多个步骤用于组织处理。此外，它们与长期用福尔马林固定的存档的组织不相容。

组织澄清的整个过程可以被视为组织折射率(RI)均质化(即，均质化组织的折射率或使组织的折射率更均一)。目前可用的方法可分为(1)水基简单RI均质化，(2)脱脂辅助的RI均质化，和(3)有机溶剂基RI均质化。后两种类别各自具有其各自的优势，但可能引起显著的组织损伤，并且通常不适用于死后的人体组织(表1)。

表1

相反，即使类别(1)造成的损害最小，其组织澄清效果也不如其它两种方法的组织澄清效果好。这产生了对改进的水基组织澄清方法的需求，其导致改善的组织透明度和最大的结构保存。优选地，这些方法适用于人体组织，并且不仅与所有现有的化学染色方法和电子显微镜相容，而且还与未来的诊断和研究方法相容。

在基础研究中对三维成像和分析的需求增加。三维成像有助于在发育和发病过程中理解器官的生物结构和功能。染色后的组织澄清导致改善的图像质量。

本发明的一个目的是提供一种具有改善的组织澄清能力的组织澄清组合物。

本发明的另一个目的是提供改善的澄清组织的方法。

本发明的另一个目的是提供改善的澄清人体组织的方法。

发明简述

本文公开了用于澄清组织的组合物和方法，所述组织用于例如随后的三维分析。在一些形式中，所公开的组织澄清组合物由三个核心组分组成：

(1)均质剂(如N-甲基葡糖胺(NMG)、尿素或乙二胺)；

(2)细胞质、水溶性RI调节剂(如碘海醇、硫代硫酸钠或聚乙二醇)；和

(3)膜、脂溶性RI调节剂(如2,2'-硫代二乙醇(TDE)或丙二醇)。

在优选的形式中，所公开的组织澄清组合物不含洗涤剂或变性剂，其允许保留脂质膜用于亲脂性追踪和随后的成像。在一些形式中，所公开的方法可以包括在公开的组织澄清组合物中组织的单步孵育。