[发明专利]包含金属结合基序的IgG结合多肽的靶-结合多肽突变体

说明书

本发明属于蛋白工程和纯化领域。本发明涉及IgG结合多肽(例如蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白M)的靶‑结合多肽突变体，其包含金属结合基序。本发明更密切地涉及Fc结合配体，其包含基于蛋白A衍生的Z结构域的工程蛋白，钙结合EF‑环已被引入至所述结构域。

发明领域

本发明属于蛋白工程和纯化的领域。本发明涉及IgG结合多肽(例如蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白M)的靶-结合多肽突变体，其包含金属结合基序。本发明更密切地涉及一种Fc结合配体，该配体包括基于蛋白A衍生的Z结构域的工程蛋白，钙结合EF-环已被引入至所述结构域。

背景

抗体是生物科学中应用最广泛的试剂之一，治疗性抗体领域正以每年近1000亿美元的全球年销售额不断增长¹。抗体的纯化一般采用基于蛋白A的亲和色谱进行²，这是一种在单一纯化步骤中得到纯的浓缩产物的简单而可靠的方法^3,4。主要缺点是为了洗脱而需要酸性pH (3-4)。由于许多抗体对低pH敏感，其可能导致抗体聚集或甚至失去其功能^5,6，这就阻碍了新的基于抗体的工具的开发和纯化。

为了改善蛋白A柱上捕获的抗体的洗脱环境，人们进行了各种各样的尝试。实例包括蛋白A衍生的Z结构域的结合位点突变⁷和所述结构域的环工程改造⁸，这可使洗脱pH增加至4-4.5。已表明在洗脱缓冲液中加入尿素或精氨酸可抑制蛋白聚集^6,9，并且已进行降低蛋白A的结构域的疏水性的突变，这产生允许在40℃洗脱的热应答蛋白A ¹⁰。

自然界控制蛋白活性的一种方法是改变三维结构。含EF-手基序的钙结合蛋白是由钙离子变构控制的。这些蛋白质一旦与钙结合，就会经历构象变化，这使离子调节功能成为可能^11,12。钙离子通过在由12个氨基酸组成的EF-手中存在的环来配位，其中在蛋白基序内的某些位置保留了氨基酸，而其它位置则是较灵活的¹³。EF-环基序已成功地接枝到模型蛋白上¹⁴。

金属结合在蛋白质工程中已被用于纯化目的。已报道了一种基于EF-手子结构域的钙分离蛋白，其可用作用钙依赖性洗脱纯化蛋白的标记和亲和手柄¹⁵。此外，来自链球菌蛋白G的抗体结合结构域之一被工程改造成含有金属结合位点，导致该结构域失去了其使免疫球蛋白G (IgG)与存在的过渡金属结合的能力¹⁶。

如上文涉及常规蛋白A色谱所述，需要酸性洗脱可能不利于要纯化的抗体或Fc-融合蛋白。此外，已知酸性pH增加蛋白的聚集，导致较低的产率。因此，具有允许在比现有技术pH 3-4.5更高的pH下洗脱的蛋白A配体将是理想的。

发明概述

本发明通过提供一种工程化蛋白来解决上述及其它问题，所述工程化蛋白优选基于蛋白A衍生的Z结构域，向其中已引入了金属结合环，优选钙结合EF-环。工程化蛋白结构域可用来在远高于使用现有技术配体可能的pH下，以温和洗脱的方式纯化抗体。本发明的新配体尤其为抗体和Fc-融合蛋白纯化提供了一种有价值的新工具。

在第一个方面，本发明涉及IgG-结合多肽的靶-结合多肽突变体，其包含金属结合基序，其中靶结合在金属离子的存在下发生。IgG-结合多肽优选衍生自蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白M，更优选葡萄球菌蛋白A (SpA)的突变体结构域。

本发明的多肽突变体优选地是Fc-结合的，即具有结合抗体的Fc部分，或其包含至少Fc-部分的部分，或与Fc-部分聚集或融合的其它蛋白的能力。

在一个优选的实施方案中，Fc-结合突变体是从SpA结构域B衍生的结构域Z的突变体。