[发明专利]牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法

说明书

本发明提供了一种牛精子等的牛生殖细胞的冷冻保存液以及冷冻保存方法。使用在生理溶液中溶解了0.3～0.9w/w％的对数均分子量为1000～20000的ε‑聚赖氨酸的氨基的50～99％(摩尔)与琥珀酸酐发生反应而引入适当量的羧基的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和2～4w/w％的甘油的冷冻保存液。在冷冻保存方法的优选实施方式中，包括：用生理溶液将牛的精液稀释至2.5～10倍，并在2～8℃保持的第一稀释工序；以及保持在2～8℃的同时，通过点滴将添加有两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液添加到通过第一稀释工序获得的悬浮液中，进一步稀释将牛的精液稀释至5～20倍的第二稀释工序。

技术领域

本发明涉及一种例如对于牛生殖细胞的冷冻保存有用的冷冻保存用组合物以及冷冻保存方法。

背景技术

为了长期保存动物的细胞或者组织，日常使用在0℃以下温度的冷冻保存方法。然而，当动物的细胞或者组织包含水而进行冷冻时，由于在冷冻中水分子一边排除溶质和混入物的介质一边结晶化，形成仅由水分子形成的冰晶，因此在含水物中溶质和混入物的介质不均匀地扩散，而发生冷冻浓缩。

为了防止这种冷冻浓缩，进行了添加各种低分子化合物的方法。例如，在进行细胞的冷冻保存时，为了将冷冻保存中引起的因细胞内的结晶化对细胞造成的损害抑制到最低限度，进行了添加低分子的二甲基亚砜或甘油等作为冷冻保护剂的方法。

特别是，为了提高牛的子畜生产力，开发一种对牛生殖细胞有用的冷冻保存方法变得重要。

例如，作为用于冷冻牛精子的冷冻保护剂，已知有甘油。另外，作为用于冷冻牛卵子以及胚胎的冷冻保护剂，已知有甘油、乙二醇、丙二醇。进一步地，作为用于冷冻牛体细胞的冷冻保护剂，已知有二甲基亚砜。

然而，这些以往的冷冻保护剂无论哪一种都存在细胞毒性强这样的问题。

同时，PCT/JP2009/002941(日本专利特许第5726525号)公开了一种包含在侧链具有氨基和羧基的两性高分子电解质的冷冻保存液。然而，尚不知该冷冻保存液能够用于生殖细胞或体细胞等牛细胞的冷冻保存。

如上所述，为了提高牛的子畜生产力，开发一种对牛生殖细胞有用的新型冷冻保存剂以及冷冻保存方法变得重要。然而，以往的用于冷冻牛细胞的冷冻保护剂无论哪一种都存在细胞毒性强这样的问题。

发明内容

因此，鉴于这些情况，本发明的目的在于提供一种对包含牛生殖细胞的牛细胞的冷冻有用的冷冻保存用组合物以及冷冻保存方法。

为了解决上述问题而进行广泛研究的结果，发现通过将ε-聚赖氨酸(PLL)的氨基与琥珀酸酐反应而引入适当量羧基的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)单独使用或者与以往的冷冻保护剂合用，对牛生殖细胞或体细胞的冷冻保存有用，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下。

一种牛精子等牛生殖细胞的冷冻保存用组合物以及使用该组合物的冷冻保存方法，其包含两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油，所述两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％。

＜化学式I＞

＜化学式II＞

发明效果

根据本发明，能够提供一种对牛生殖细胞有用的冷冻保存用组合物，并且能够提高牛的子畜生产力。另外，根据本发明，能够提供一种对牛体细胞具有低毒性的冷冻保存用组合物。

附图说明

图1为表示将冷冻胚胎封入专用吸管的封入方式的图。