[发明专利]用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

Reprimo基因是近年来发现的一种潜在的抑癌基因，位于人类染色体2q23上，是调控细胞正常生长的基因之一。其编码的蛋白位于胞质，是一种高度糖基化的蛋白，是p53介导的细胞周期调控的下游信号，可使异常的细胞停滞在G2期，阻止细胞增殖。Reprimo启动子异常甲基化可以抑制转录，引起G2/M检查点调控发生紊乱，导致细胞异常增殖。Reprimo基因甲基化及其表达的缺失与多种癌症或肿瘤细胞株相关，其中包括胃癌、胆囊癌、淋巴瘤、大肠癌、食管腺癌、乳腺癌及白血病，其中Reprimo基因启动子甲基化在胃癌患者中占比率大于70％。此外，胃癌患者血浆中发现的APC，SHP1，E-cadherin，ER，Reprimo，SEMA3B，and 3OST2等7种高频率甲基化的基因中，只有Reprimo基因在非胃癌患者的血浆中是呈显著性低频率甲基化，这说明Reprimo可以做为胃癌早期的肿瘤标志物。另一方面，增强Reprimo mRNA及蛋白的表达通过使用去甲基化制剂可使抑癌基因重获作用，其干扰下可能减少Reprimo异常甲基化的发生，并且联合应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂后，抑制肿瘤细胞生长的效果更显著，这为肿瘤的治疗提供了实验依据，对肿瘤患者预后有重要意义。

RNF180基因在人类基因组中定位于5q12.3，是一个新型的环指基序基因，有泛素连接酶活性和蛋白质泛素化功能。RNF180通过对底物的泛素化进而决定了其靶向特异性及时序性，在细胞信号转导、细胞凋亡、基因转录及DNA修复等介导蛋白降解，RNF蛋白在肿瘤中表达的异常下调表现为抑癌因子的作用。全基因组甲基化的筛选结果显示RNF180基因在肿瘤中优先进行甲基化，RNF180基因甲基化的沉默导致了RNF180蛋白酶体途径失调，在肿瘤发生和进展中起重要的作用。进一步的研究表明，RNF180表达缺失和低表达与RNF180基因核心启动子区域的甲基化呈负相关。通过组织水平验证发现，原发性胃癌组织相对癌旁组织中RNF180mRNA和蛋白表达显著性下降，在胃癌的体外细胞株实验中RNF180经常性缺失和下调，以上结果均与RNF180基因核心启动子甲基化密切相关。

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应，CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域。DNA经重亚硫酸盐处理后，甲基化的胞嘧啶不变，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。用特异性引物PCR扩增的方法扩增出相应的片段，再进行DNA测序，区分胞嘧啶的甲基化和非甲基化。如果已经确定了甲基化位点，可应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)进行检测。

目前，传统的甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用；此外，市面上未见有针对Reprimo基因、RNF180基因甲基化联合检测的试剂盒产品。

因此，有必要提供一种新的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物组、试剂盒及方法来克服上述缺陷。本发明采用荧光实时PCR技术，对病人血浆游离核酸Reprimo基因、RNF180基因甲基化联合检测，通过对样本进行重亚硫酸盐处理后，采用特异性引物和探针对核酸进行扩增，以达到快速检测Reprimo基因、RNF180基因甲基化的目的，最终为人胃癌早期诊断提供有效信息，为人胃癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。

发明内容

为了解决上述传统甲基化检测方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的技术问题，本发明提供一种操作简单、准确性高及敏感性高且基于荧光PCR技术的用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对、试剂盒及其方法。

本发明提供了一种用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对，包括针对Reprimo基因与RNF180基因的启动子区以及β-Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：

Reprimo正向引物：5'-TGCGAGTGAGCGTTTAGTTC-3'(SEQ ID NO.1)，