[发明专利]不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用

说明书

本发明提供了不同组织中杉木内参基因的筛选方法和内参基因的应用，属于荧光定量PCR检测领域。所述筛选方法以甘油醛三磷酸脱氢酶基因、转录延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素基因为候选内参基因，以候选内参基因为模板设计引物；提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；将cDNA为模板进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；根据相对表达量Q值和Ct值采用多个软件对候选内参基因进行稳定性评价；将候选内参基因的稳定性由强到弱排序，选择排序前两位的候选基因作为杉木的内参基因。筛选得到的18S rRNA和/或泛素基因作为杉木不同组织中的内参基因的应用。

技术领域

本发明属于荧光定量PCR检测技术领域，具体涉及不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用。

背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国最重要的针叶速生用材树种之一，具有生长快、单产高、材质好等特性。杉木的木材纹理通直，结构均匀，耐腐蚀性强，抗虫性较好，被广泛应用于制作家具，建造桥梁、船只等方面。同时，杉木作为常绿针叶树种，树干通直圆满，树冠呈圆锥形，喜光，萌芽更新较好，生长迅速，常作为园林部门推广的优良树种，具有良好的景观和园林欣赏价值。

基因的表达分析现已广泛应用于生物科学的研究中，对于探求基因的表达情况、调控机理的方面均起到至关重要的作用。在转录水平进行基因的表达分析的方法，如实时荧光定量PCR、RNA印迹、基因芯片等，都需要内参基因对目标基因的表达量进行校正与标准化，便于获得真实可靠的结果。然而实时荧光定量PCR结果的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。内参基因稳定性高，能更好的为目的基因的表达进行校正。理想的内参基因是在各个实验条件下，能在各个组织或者细胞中均能恒定表达的基因。而大量研究分析表明，大量潜在的内参基因的稳定性也是均有相对性的，在不同的细胞类型情况下，相同的内参基因的表达并不是恒定不变的。

近年来，植物内参基因的筛选已有许多报道，同时越来越多的学者对杉木的分子调控机制进行研究，分子调控机制很大程度上依赖于目标基因的表达情况，而目标基因的表达情况通常采用实时荧光定量PCR方法进行检测得到，由于杉木基因组与转录组序列的限制，对杉木在不同研究中的内参基因的筛选的报道还较少，也没有关于筛选杉木不同组织中内参基因的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供不同组织中杉木内参基因的筛选方法和内参基因的应用，所述筛选方法能够得到在不同组织中均稳定表达的内参基因，且所述内参能够正确校正目的基因的表达情况。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了不同组织中杉木内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

1)根据候选内参基因的核苷酸序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；

所述候选内参基因分别是甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因、转录延伸因子、18SrRNA、28S rRNA和泛素编码基因；

所述甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

2)提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；

3)将所述步骤2)中cDNA为模板，用所述步骤1)中引物进行qPCR扩增，得到C_t值和相对表达量Q；所述相对表达量Q按照式I计算得到；

Q＝2^-△△C_t 式I