[发明专利]不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用

权利要求书

1.不同组织中杉木内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

1)根据候选内参基因的核苷酸序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；

所述候选内参基因分别是甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因、转录延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素编码基因；

所述甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述转录延伸因子为序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA为序列表中SEQID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA为序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因为序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

2)提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；

3)将所述步骤2)中cDNA为模板，采用所述步骤1)中引物进行qPCR扩增，得到C_t值和相对表达量Q；所述相对表达量Q按照式I计算得到；

Q＝2^-△△C_t 式I

4)根据所述步骤3)中相对表达量Q值，采用geNorm和Normfinder软件对所述候选内参基因进行稳定性评价；

5)根据所述步骤3)中Ct值，采用BestKeeper软件对候选内参基因进行稳定性评价；

6)根据geNorm软件、Normfinder软件和BestKeeper软件做出的稳定性评价结果，将所述候选内参基因按照稳定性由强到弱进行排序，选择综合排序第一的候选基因作为杉木的内参基因，所述候选基因为18S rRNA；

所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制，所述步骤4)和步骤5)之间没有时间顺序的限制。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中特异性扩增甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因的引物为序列表中SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

特异性扩增转录延伸因子的引物为序列表中SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；

特异性扩增18S rRNA的引物为序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；

特异性扩增28S rRNA的引物为序列表中SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；

特异性扩增泛素编码基因的引物为序列表中SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中qPCR扩增体系如下：2XqPCR反应液10μl，10X正向引物和10X反向引物各0.4μl，模板cDNA 2μl，CXR参考染料液0.2μl和ddH₂O 7μl。

4.根据权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于，所述3)中qPCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环；95℃30s，60℃30s，逐渐升温到95℃。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤6)中综合排序的方法如下：

geNorm软件和Normfinder软件对候选内参基因的稳定性评价结果中，5个候选内参基因的稳定性指数M值由小到大进行排序，M值最小的候选内参基因记为5分，第二最小M值的候选内参基因记为4分，第三最小M值的候选内参基因记为3分，第四最小M值的候选内参基因记为2分，M值最大的候选内参基因记为1分；

BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性评价结果中，5个候选内参基因的标准差和/或变异系数由小到大进行排序，标准差和/或变异系数最小的候选内参基因记为5分，第二最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为4分，第三最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为3分，第四最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为2分，标准差和/或变异系数最大的候选内参基因记为1分；

将三个软件得到的每个候选基因的得分相加，根据各候选内参基因的分值加和由大到小进行排序。

6.18S rRNA基因作为杉木不同组织中的内参基因的应用，其特征在于，所述扩增18SrRNA的引物序列为序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；所述杉木不同组织包括根、茎和叶组织；所述杉木的树龄为一年生小苗。