[发明专利]一种1;5-脱水山梨醇的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种1,5‑脱水山梨醇的检测试剂盒及其检测方法。本发明的检测试剂盒能够使样本在反应循环过程中达到能量供应，消除样本中葡萄糖和试验副产物葡萄糖6‑磷酸、丙酮酸干扰，避免因产物的积累造成的逆反应。在消除葡萄糖及副产物积累后，使1,5‑AG转化成1,5‑脱水‑果糖与过氧化氢，过氧化氢与发光底物反应形成一种持续稳定的化学发光信号。与传统的酶比色法相比，本发明的检测试剂盒具有灵敏度高、准确性好、特异性高、抗干扰能力强、稳定性好等优点。

技术领域

本发明涉及生化试剂技术领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

1,5-AG(1,5-脱水山梨醇)与现有的糖尿病指标均呈现出显著的负相关，血液中1,5-AG的减少程度与糖尿病的严重程度显著相关。1,5-AG与其他指标最显著的区别是反映糖尿病病情变化的周期不同，血糖(GLU)反映病人当时血糖状况，糖化白蛋白(GA)反应病人半个月内血糖的平均状况，糖化血红蛋白(HbAlc)反映病人最近2～3个月左右的血糖平均水平，而1,5-AG可以反映近几天至1周的平均血糖水平。

目前国内外市场主要采用酶法对1,5-AG进行检测，酶法测定由于其无污染，并可试用与生化仪，操作简单等特点，有利于大规模推广。目前国内外主要采用酶法测定1，5-脱水山梨醇(1,5-AG)，主要有氧化酶法与脱氢酶法两种方法。氧化酶法的原理为，通过吡喃糖氧化酶(PROD)催化1，5-脱水山梨醇(1,5-AG)生成1，5-脱水果糖和H₂O₂，H₂O₂在过氧化物酶的作用下使4-AAP和TOOS反应生成醌类有色物质。脱氢酶法的原理为：1,5-脱水山梨醇在ADP依赖性己糖激酶(ADP-HK)的作用下生成AG-6磷酸(AG-6-P)。AG-6-P再和NADP进行反应，生成NADPH。NADPH具有还原性，和显色剂作用生成显色物质。

在1,5-AG检测中，由于葡萄糖与1,5-AG结构极其相似，导致葡萄糖成为检测1,5-AG的最大干扰。目前葡萄糖的消除主要采用己糖激酶法将葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖，继而转化成葡萄糖酸。

研究表明，丙酮酸是一种抗氧化剂，作为一种α-酮酸，丙酮酸可直接通过非酶促的去碳酸基反应抑制过氧化氢，从而消除过氧化氢。内源性丙酮酸及采用消除葡萄糖后产生的丙酮酸会严重干扰已产生的过氧化氢的检测，现有技术中仅针对葡萄糖的消除，但试剂盒中消除葡萄糖后产生丙酮酸仍需进一步改进。

另一方面，1,5-脱水山梨醇的酶法试剂盒存在信号弱，反应强度低，空白信号高、检测限高、易受葡萄糖、胆红素、抗坏血酸、血脂等内源性干扰，稳定性、灵敏度、特异性等方面仍需要进一步改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供了一种1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒，解决试剂盒中葡萄糖消除过程中供能不足问题、副产物葡萄糖6-磷酸、丙酮酸积累造成负干扰、检测信号弱以及低浓度样本检测不准确的问题。

本发明的另一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒的检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒，所述试剂盒包括用于消除葡萄糖、葡萄糖6-磷酸和丙酮酸的试剂R1、用于将1,5-脱水山梨醇转化成1,5-脱水果糖与过氧化氢的试剂R2和用于检测过氧化氢的发光底物；所述试剂R1包括为腺苷三磷酸、己糖激酶、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶；所述试剂R2包括吡喃糖氧化酶。

本发明的检测试剂盒的检测原理如下：