[发明专利]对铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法

说明书

本发明提供了一种密对铜绿假单胞菌‑烟曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法，包括以下步骤：烟曲霉孢子悬液的制备；铜绿假单胞菌野生菌株及其缺陷菌株菌液的制备挑取铜绿假单胞菌野生菌株单菌落及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株单菌落，分别接种于培养基中，再稀释；体外静止两种混合生物被膜模型的建立实验分为6组，每组接种于细胞培养板，其中每孔已事先各放置圆形玻璃细胞爬片，再将野生型铜绿假单胞菌液及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌液分别加入相应组中，恒温孵育；对于上述步骤中不同生物被膜形成后，进行定量分析。本发明明确了铜绿假单胞菌密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的形成具有显著的抑制作用。

技术领域

本发明涉及一种抑制生物被膜的方法，具体涉及一种体外抑制铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的研究方法，属于生物相关技术领域。

背景技术

铜绿假单胞菌及烟曲霉菌是自然界中较常见的细菌及真菌，且为较常见的条件致病菌。无论是慢阻肺继发肺内感染还是支扩肺内常见定植菌，亦或是近年发病率显注升高的肺结核合并细菌真菌感染，铜绿假单胞菌及烟曲霉菌均为培养所常见的菌类。细菌及真菌在人体内生长主要以形成生物被膜的方式存在，混合感染则可形成混合生物被膜使之发挥更强大的耐药性。目前国内外对于混合生物被膜的研究报导较少，国内外文献有关于铜绿假单胞菌及烟曲霉菌的研究仅限于铜绿假单胞菌对于烟曲霉菌的抑制作用的研究，而没有深入到两者所形成的混合生物被膜的研究领域，这就给了该项研究的很大空间。

密度感应系统是指细菌通过监测其群体的细胞密度，利用自身信号分子来调节特定的基因表达，以保证生物被膜中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。密度感应系统对于细菌的调节作用包括：生物膜形成，生物发光，独立基因的调节，抗生素的产生等等。

利用铜绿假单胞菌的密度感应系统对铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的研究尚属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外抑制铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的方法，以弥补现有技术的不足。

铜绿假单胞菌的密度感应系统主要包括：las、rhl、pqs三个系统，其中las系统活化大量调节因子如rhlR.rhlI的转录，因而其在铜绿毒力决定因素的调节中占重要地位。其中las由lasR、lasI基因组成，rhl由rhlR、rhlI基因组成。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

一种密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法，包括以下步骤：

(1)烟曲霉孢子悬液的制备；

(2)铜绿假单胞菌野生菌株及其缺陷菌株菌液的制备：挑取铜绿假单胞菌野生菌株单菌落及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株单菌落，分别接种于RPMI-1640培养基中，再稀释；

(3)体外静止两种混合生物被膜模型的建立实验分为6组，依次是烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组(A·f+PAO1)，烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组(A.f+P.alasI/rhlI)，烟曲霉菌组(A.f)，野生型铜绿假单胞菌组(PAO1)，铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组(P.a lasI/rhlI)，RPMI-1640培养基作为空白对照组，每组接种于细胞培养板，其中每孔已事先各放置圆形玻璃细胞爬片，再将野生型铜绿假单胞菌液及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌液分别加入相应组中，恒温孵育；

(4)对于上述步骤(3)中不同生物被膜形成后，进行定量分析。

进一步的，所述步骤(1)具体为：受试烟曲霉菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，收集孢子，配置RPMI-1640培养基；将收集到的孢子液加入到该RPMI-1640培养基内，用血细胞计数板调节孢子浓度，作为建立体外混合生物被膜模型的孢子悬液。