[发明专利]蔬菜中肠出血性大肠埃希氏菌的PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种蔬菜中肠出血性大肠埃希氏菌PCR检测方法，尤其涉及一种优化的微滴数字PCR检测反应体系。所述的微滴数字PCR检测方法包括以下步骤：a.制备样品和增菌培养；b.提取细菌模板DNA；c.以提取的DNA为模板，加入上述的引物和带荧光染料的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，所述的反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹模板DNA，高于阈值的微滴包裹模板DNA，为阳性微滴，低于阈值的微滴不包裹模板DNA为阴性微滴，本发明提供的检测方法工作流程简单，又兼具实时荧光定量PCR方法的优点，可实现核酸绝对定量分析，并且又具有高通量样品处理能力，实用性强。

技术领域

本发明属食品卫生检测技术领域，具体涉及一种蔬菜中肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇的微滴数字PCR检测方法。

背景技术

肠出血性大肠埃希菌（enterohemorrhage E．Coli，EHEC）是大肠埃希氏菌的一个亚型，EHEC的主要致病机制是产生的毒素能使 vero 细胞产生病变，故称 vero 毒素。又因与志贺氏菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦称志贺氏样毒素（SLT）或志贺氏毒素Stx。其中肠出血性大肠埃希菌O₁₅₇:H₇是主要的致病菌株。自1982年美国从出血性肠炎患者粪便中分离出肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇至今，肠出血性大肠埃希菌 O₁₅₇:H₇感染的爆发及散发疫情已遍布6大洲30多个国家。中国于1986年首次从江苏省徐州市腹泻病患者粪便标本中分离到肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇，1999-2000年安徽、江苏、河南等地发生肠出血性大肠埃希菌O₁₅₇:H₇感染性腹泻的大规模爆发流行。

目前国内外鉴别肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇的方法可分为传统方法、免疫方法和分子检测方法，传统的分离培养法和生化鉴定时间长，灵敏度低；与之相较，免疫学方法缩短了检测时间，但是容易发生肠出血性大肠埃希菌的多种血清型的交叉反应；随着聚合酶链式反应（PCR）方法的发展，实时荧光定量PCR技术已成功用于肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇的检测中，具有特异性强、灵敏度高和快速等优点。

微滴数字PCR方法（Droplet digital PCR, dd PCR）是近年来在PCR技术基础上发展起来的另一种快速、准确、可实现DNA绝对定量一种PCR方法。在鉴别肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇的工作中，微滴数字PCR检测方法是前沿的技术手段，也是最精确和最敏感的检测方法。其原理是将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，再进行PCR反应；因为在制作微滴时，只有部分微滴可包裹到目的基因，所以PCR反应结束后检测所有微滴的荧光信号值，判断阳性微滴即包裹到目的基因的微滴，再根据泊松分布计算目的基因拷贝数。与实时荧光定量PCR方法相比，本方法无需根据外部核酸标准品，无需标准曲线，工作流程简单，又兼具实时荧光定量PCR方法的优点，可实现核酸绝对定量分析，并且又具有高通量样品处理能力，实用性强。