[发明专利]蔬菜中肠出血性大肠埃希氏菌的PCR检测方法

权利要求书

1.微滴数字PCR检测肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇的引物和探针，碱基序列分别为：

rfbE基因上游引物： CTGTAAGTAATGGAACGGTTG；

rfbE基因下游引物： GTCAGTGTTGGAACAATAACT；

rfbE基因探针： ATCTCCTTCCGATATACCTAACGC，其特征在于：所述的rfbE基因探针带荧光染料，5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。

2.微滴数字PCR检测肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇的优化方法，其步骤如下：

a. 制备样品和增菌培养；

b. 提取细菌模板DNA；

c. 以提取的DNA为模板，加入上述的引物和带荧光染料的探针以及酶反应液进行微滴数字PCR反应，反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹模板DNA，高于阈值的微滴包裹模板DNA，为阳性微滴，低于阈值的微滴不包裹模板DNA为阴性微滴，再根据阳性微滴数计算模板DNA的拷贝数，根据阳性拷贝数值判定结果。

3.根据权利要求2所述的微滴数字PCR检测肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇的优化方法，其特征在于：所述的微滴数字PCR反应体系为：

2×dd PCR预混液 10µL，

10 µmol/L rfbE基因上游引物 1µL，

10 µmol/L rfbE基因下游引物 1µL，

10 µmol/L rfbE基因探针 1µL，

双蒸水 2µL，

1～100 ng/µL模板DNA 5µL，

去离子水补足反应体积为20µL。

4. 根据权利要求3所述的微滴数字PCR检测肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇的优化方法，其特征在于：所述的微滴数字PCR反应条件为95℃/5min，1个循环；94℃/15s，60℃/1min，60℃时收集 FAM 荧光，50个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；或者95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物。

5.根据权利要求4所述的微滴数字PCR检测肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇的优化方法，其特征在于：所述的微滴数字PCR检测方法还设有空白对照、阴性对照和阳性对照，判定标准为：

阳性对照：以肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇阳性成分DNA为模板，按照所述的微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行微滴数字PCR反应，检测出肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值；

阴性对照：以非目标源性成分DNA为模板，按照所述的微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行微滴数字PCR反应，检测出肠出血性大肠埃希氏菌O₁₅₇:H₇基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值；

空白对照：以双蒸水为模板，按照所述的微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行微滴数字PCR反应，检测出肠出血性大肠埃希氏菌O_157:H₇基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。