[发明专利]一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法

说明书

本发明公开了一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，属于基因敲除领域。该方法通过CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计，构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成，斑马鱼胚胎进行显微注射，检测靶位点的有效性，注射两个月之后，进行剪尾鉴定，对目的序列进行TA克隆，质粒进行Sanger测序获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代，从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交获得斑马鱼突变体的F2，从中挑选出F2代纯合子，进行F3代纯系遗传得到rmnd5b基因缺失型斑马鱼品系。本发明方法脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。

技术领域

本发明属于基因敲除领域，更具体地说，涉及一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法。

背景技术

RMND5B(required for meiotic nuclear division 5homolog B)基因位于人类5q35.3，编码391个氨基酸。一般认为该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达，在心脏、肝和肾中的表达水平较强。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现RMND5B基因与心脏早期发育密切相关。

斑马鱼与人类在心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且RMND5B基因进化上较为保守，人类RMND5B基因对应于斑马鱼rmnd5b基因，研究发现rmnd5b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于心脏发育的观察。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。

发明内容

针对现有基因打靶技术中存在的脱靶率相对较高问题，本发明提供了一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。

解决上述技术问题的技术方案如下：

A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计

在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响rmnd5b基因的整个结构域，从而改变基因的表达。

两对特异性PCR引物如下：

F1(靶位点a正向引物)：