[发明专利]一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法

权利要求书

1.一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计

在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点；

两对特异性PCR引物如下：

F1(靶位点a正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

F2(靶位点b正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT

B.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成

(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)特异性gRNA体外合成；

用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，体系如下：

离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上；

(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；

>PCR引物

PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：

F(5’-GCCAGTGCTGCTGACATGACTAATA-3’)

R(5’-GAACACAGACCCACAAGACACAAGT-3’)

正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bp gRNA上游骨架

反向引物R：20bp gRNA下游骨架

PCR反应体系(25μL)如下：

震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；

(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；

(5)测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：

体外转录反应体系(20μL)：

将反应物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h，水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功，向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率；

(6)特异性gRNA的纯化

用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；

C.斑马鱼胚胎的显微注射

尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射约1.8nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；

显微注射体系如下：

D.T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性

对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rmnd5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；斑马鱼胚胎受精50小时后(50hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管10只胚胎)，提取基因组DNA；

PCR扩增目的序列

提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；

PCR反应体系(50μL)如下：

震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确，若PCR产物正确，则用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外下切下目的条带，进行纯化回收；

T7核酸内切酶I(T7E1)法

首先，取纯化回收之后的DNA 15μL装于150μL的Ep管中，置于95℃热水中进行变性，然后自然冷却至室温(至少30min)。再取变性之后的DNA进行T7E1酶切，体系如下：

混匀体系后，于37℃水浴锅中酶切反应30min，再用2％的凝胶进行电泳，以检测目的DNA片段是否被切开，如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率，同时送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；

E.注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤

F.目的序列的TA克隆

T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；

G.质粒的Sanger测序

H.获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代

通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率，受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出309bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代，如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；

I.获得斑马鱼突变体的F2代纯合子

从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精三天后取部分胚胎进行鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出309bp靶位点附近区域，通过转化、挑单克隆并测序，初步检验是否可以得到rmnd5b突变体纯合子，如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；

J.同上可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。