[发明专利]基于类核酸辅酶A-Cu（II）配位聚合物的焦磷酸酶电化学生物传感器的制备方法及应用

说明书

本发明公开了基于类核酸辅酶A‑Cu(II)配位聚合物的焦磷酸酶电化学生物传感器的制备方法及应用，具体步骤如下：(1)取Cu²⁺溶液，辅酶A水溶液，剧烈振荡得CoA‑Cu(II)CP；(2)依次取PPi溶液，Cu²⁺溶液，Mg²⁺溶液，Tris‑HCl缓冲液(pH 7.4)，PPase于EP管中，剧烈振荡混合均匀，加入CoA；(3)取PPase于EP管中，加入NaF，剧烈震荡混合均匀，再加入PPi溶液，Cu²⁺溶液，Mg²⁺溶液，Tris‑HCl缓冲液(pH 7.4)，剧烈振荡混合均匀，加入CoA；(4)石墨烯分散于醋酸缓冲液中，用循环伏安法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极得到GO/GCE，取(1)或(2)或(3)中的溶液滴涂于GO/GCE上，室温静置即得电化学传感器CP/GO/GCE。用于检测PPase活性及其小分子抑制剂，优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器及其检测方法，尤其是涉及一种基于类核酸辅酶 A-Cu(II)配位聚合物的焦磷酸酶电化学生物传感器的制备方法及其应用，属于功能材料和生物传感技术领域。

背景技术

焦磷酸酶(PPase)是一种以焦磷酸盐(PPi)为底物的水解酶，作用于双磷酸键上的酸酐，可催化一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子。PPase广泛存在于自然界，参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸盐的水解。不仅如此，焦磷酸酶在脂代谢(包括脂合成与分解)、钙吸收以及骨形成和DNA合成中扮演重要角色。临床上发现该酶低表达对癌症患者的治疗效果及生存期均优于高表达者，因此患者组织或细胞中焦磷酸酶的活性检测及其抑制剂的筛选，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后评价具有很高价值。

目前，关于焦磷酸酶的检测主要集中在荧光传感体系的研究，具有一定的灵敏度和准确度，但存在一些不足之处：仪器昂贵、操作复杂、技术要求高等，因此，迫切需求开发灵敏、准确、快速、简便的焦磷酸酶活性检测方法。电化学生物传感器是将电化学强大的分析功能与生物识别过程的特异性相结合，目的是通过生物反应产生一个与被分析物质浓度相关的电信号。为此目的，使用一个生物特异性试剂固定化或保持在适当的电极上，该电极将生物识别信号定量转换成电流或电位响应。电化学生物传感器因具备快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点被广泛运用。目前为止，焦磷酸酶相关的电化学生物传感研究非常稀少。

辅酶A(CoA)作为一种含有巯基的生物小分子，其结构主要由三部分构成：3’- 磷酸腺嘌呤结构以及类半胱氨酸结构，中间由泛酸基团连接。CoA两端的两个功能基团：一个是腺嘌呤结构，另一个是巯基基团。这种特殊结构使得CoA有可能成为生物化学相关研究的重要物质，如果能够同时利用CoA两端的两个功能基团进行生物化学检测，势必会增加其检测的特异性以及选择性。基于CoA末端的巯基，将其与币族金属离子混合反应，通过巯基和金属离子的作用能够形成很多CoA-金属离子的重复单元，合成一种特殊的配位聚合物，因为CoA末端的类腺嘌呤结构，使得该配位聚合物的骨架上有很多腺嘌呤基团，具备类似RNA的结构，在一定程度上能够扮演RNA的角色参与生物传感体系的构建。我们课题组已经对辅酶A和银离子或是金离子形成的配位聚合物进行了深入探讨，但是关于辅酶A和铜离子的配位聚合物的研究甚少，由于该类RNA配位聚合物本身良好的电化学催化性能及生物兼容性，非常适合用于开发电化学生物传感器。

石墨烯(GO)是一种由碳原子以sp2杂化方式形成的蜂窝状平面薄膜，是至今发现的最薄二维材料，具有比表面积大、边缘位点多、表面能高、催化性能好、生物相容性好等优点，在电化学生物分析领域中广泛应用。首先，石墨烯可以加快电极表面的电子传递速度、有效增大电化学信号，使传感器的灵敏度大大提高；其次，石墨烯骨架中的离域大π共轭体系通过非共价结合作用与含有π电子的化合物π-π共轭，可以有效地固定生物分子。该发明中形成的类RNA的配位聚合物就能通过π-π共轭作用固定在石墨烯电极的表面，为焦磷酸酶电化学生物传感器的构建奠定基础。