[发明专利]基于类核酸辅酶A-Cu（II）配位聚合物的焦磷酸酶电化学生物传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.基于类核酸辅酶A-Cu(II)配位聚合物的焦磷酸酶电化学生物传感器，其特征在于，该电化学传感器是通过以下方法构建得到的：

首先，利用氧化石墨烯修饰裸玻碳电极，得GO/GCE；其次，利用辅酶A和Cu(II)合成CoA-Cu(II)CP；再次，制备PPase活性检测反应液或PPase抑制剂NaF的检测反应液，再添加辅酶A，合成CoA-Cu(II)CP；最后，将所得的CoA-Cu(II)CP分别滴涂于GO/GCE表面，即制得CP/GO/GCE传感器；

其中，利用辅酶A和Cu(II)合成CoA-Cu(II)CP的方法是：依次取8.0～12.0μL浓度为0.8～10.0mM的Cu²⁺溶液，8.0～12.0μL浓度为1.6～20.0mM辅酶A水溶液，加蒸馏水配成80.0～100.0μL的溶液，将溶液剧烈振荡5～15min，而后置于4℃冰箱冷藏备用。

2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，PPase酶活性检测反应液的制备方法是：a.依次取5.0～10.0μL浓度为0.1～10.0mM的PPi溶液，8.0～12.0μL浓度为0.8～10.0mM的Cu²⁺溶液，5.0～10.0μL浓度为100.0～200.0μM的Mg²⁺溶液，10.0～15.0μL浓度为20.0～40.0mM的Tris-HCl缓冲液，5.0～10.0μL浓度为0.001～100.0U/L的PPase于EP管中，剧烈振荡2～5min使溶液混合均匀，将上述溶液在20～40℃下孵育1.0～1.5h，后将该EP管置于85～90℃水浴使酶失活，冷却至室温，控制酶终浓度范围为0～2U/L；b.向a中加入8.0～12.0μL浓度为1.6～20.0mM的CoA，30～50μL的H₂O混合均匀，将溶液剧烈振荡5～15min，而后置于4℃冰箱冷藏备用。

3.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，PPase酶抑制剂NaF的检测反应液的制备方法是：a.取5.0～10.0μL浓度为0.001～100.0U/L的PPase于EP管中，加入1.0～10.0μL浓度为0.01～1mM的NaF，剧烈震荡1～3min混合均匀，抑制剂NaF终浓度范围为0～120μM；b.向a中依次加入5.0～10.0μL浓度为0.1～10.0mM的PPi溶液，8.0～12.0μL浓度为0.8～10.0mM的Cu²⁺溶液，5.0～10.0μL浓度为100.0～200.0μM的Mg²⁺溶液，10.0～15.0μL浓度为20.0～40.0mM的Tris-HCl缓冲液于EP管中，剧烈振荡2～5min使溶液混合均匀，将上述溶液在20～40℃下孵育1.0～1.5h，后将该EP管置于85～90℃水浴使酶失活，冷却至室温；c.向b中加入8.0～12.0μL浓度为1.6～20.0mM的CoA，30～50μL的H₂O混合均匀，将溶液剧烈振荡5～15min，而后置于4℃冰箱冷藏备用。

4.如权利要求1～3任意一项所述的电化学生物传感器，其特征是，电化学传感器的制备方法为：a.将4.0～9.0mg石墨烯溶于2.0～10.0mL浓度为0.1～0.3M的pH 5.0～6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2～5h，得到石墨烯分散液；b.首先将玻碳电极GCE，直径为3mm在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光2～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～5min，得到裸玻碳电极；利用循环伏安法，电位范围为-1.5～0.5V，扫速为10mV/s，将氧化石墨烯电沉积到裸玻碳电极得到石墨烯修饰的玻碳电极，标注为GO/GCE；c.取2.0～7.0μL权利要求2-3任一项中所述溶液滴涂于GO/GCE上，室温下静置0.2～1.0h，即得到所需要的电化学传感器，标注为CP/GO/GCE。

5.如权利要求1～3任意一项所述的电化学生物传感器的应用，其特征是所述的基于类核酸辅酶A-Cu(II)配位聚合物的电化学生物传感器，检测其对OPD的催化作用，从而检测PPase活性。