[发明专利]一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，首先提取两种条鳎的基因组DNA，再分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，最后对两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为缨鳞条鳎，条带短的为日本条鳎。有益效果为：本发明所公开的方法能够快捷高效地鉴别日本条鳎与缨鳞条鳎，通过凝胶电泳比较两种条鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法。

背景技术

日本条鳎和缨鳞条鳎同属鲽形目鳎科条鳎属，形态上非常相近，主要通过尾鳍后半部黄色纵纹或斑点以及眼间隔是否具有鳞片进行区分。尾鳍后半部具有黄色纵纹，且眼间有鳞片的为日本条鳎，尾鳍后半部具有黄色斑点，且眼间无鳞的为缨鳞条鳎。但是由于其离水后颜色很容易就褪去，且鳞片也很容易脱落，导致两者很难通过形态特征进行鉴定，因而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。因此寻找区分日本条鳎和缨鳞条鳎的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速高效地鉴别日本条鳎与缨鳞条鳎的分子生物学方法，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供了技术支撑。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，过程为：采用标准酚-氯仿法提取两种条鳎的基因组DNA，分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，将两种扩增产物在1％-1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为缨鳞条鳎，条带短的为日本条鳎，其中扩增所采用的上游引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，下游引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG。通过凝胶电泳比较两种条鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。

作为优选，扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物，0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl₂，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。该扩增体系为扩增提供了最优的酸碱度和离子浓度，使聚合酶的活性高，提高了扩增产物的收率。

作为优选，扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响Taq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所公开的方法能够快捷高效地鉴别日本条鳎与缨鳞条鳎，通过凝胶电泳比较两种条鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的提高了工作效率；本发明所用的引物是基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8SrDNA序列设计得到，特异性极强，所扩增的ITS1进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS1长度差异非常明显，大大提高了鉴别方法的准确性。

附图说明

图1为扩增产物的电泳条带，M为DNA Marker，泳道1、2为扩增产物的电泳结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图作进一步详细描述：