[发明专利]一种降解丁酸的产甲酸产乙酸菌的分离方法

说明书

本发明在富集培养阶段以甲酸和丁酸为共底物对微生物进行驯化，通过富集甲酸型产甲烷菌来间接强化产甲酸产乙酸菌（FPAs）的生态功能，实现了对FPAs的有效富集。在分离培养阶段以丁酸代谢中间产物巴豆酸为底物，并加入2‑溴乙烷磺酸钠（2‑BES）来抑制产甲烷作用，从而避免产甲烷菌对甲酸的消耗，可以对产物中的甲酸进行有效检测，更方便直观地了解产甲酸菌的富集情况以及产甲酸菌的产甲酸能力。通过对具有产甲酸能力的微生物进行筛选，大大增加了后期成功分离培养出降解丁酸的产甲酸产乙酸菌的机率。

技术领域

本发明涉及污水生物处理及其回用领域，具体涉及一种降解丁酸的产甲酸产乙酸菌的分离方法。

背景技术

厌氧生物处理技术具有治污和产能相结合的优点，已经成为国内外重要的废水处理技术。在厌氧反应器启动过程中由于产酸发酵微生物生长代谢速率快，有机物迅速水解酸化产生大量丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸(VFAs)，如果互营脂肪酸氧化菌(SFOB)不能及时有效地将VFAs转化，VFAs的积累不仅会抑制后续产甲烷反应，并会反馈抑制剩余有机物继续水解，造成反应器“酸败”。酸积累已经成为制约厌氧处理效能和运行稳定性的瓶颈问题，这一问题的解决依赖于SFOB生态功能的加强。

在VFAs转化过程中主要存在产氢产乙酸和产甲酸产乙酸两种途径，种间氢转移在颗粒污泥体系中占主导作用，种间甲酸转移在絮状污泥中占主导作用，很多研究表明种间甲酸转移在丙酸和丁酸降解过程中也起着重要作用。这两种途径中的SFOB主要是产氢产乙酸菌(HPAs)和产甲酸产乙酸菌(FPAs)，目前对产氢产乙酸菌的研究已经相对成熟，对介导种间甲酸转移的标志性功能微生物产甲酸产乙酸菌的研究却很少，因此分离培养出降解丙酸、丁酸的产甲酸产乙酸菌，不仅可以丰富现有的厌氧微生物理论体系，也对在种间甲酸转移占主导作用的厌氧体系中酸积累问题的解决具有实际意义。

现有的丁酸氧化菌的分离方法，主要是以丁酸为底物进行驯化，通过定期检测丁酸的降解以及产物的生成情况，选择能快速降解丁酸的样品进行纯化，获得丁酸氧化菌和产甲烷菌的共生体再进行单菌的分离，所获得的纯菌大都是产氢产乙酸菌。现有的分菌方法在前期富集培养阶段没有具体针对富集产甲酸产乙酸菌的操作，生成产物中的甲酸又易被产甲烷菌消耗很难进行检测，因此无法对产甲酸产乙酸菌进行有效富集，也无法对产甲酸产乙酸菌的富集情况进行检测，造成产甲酸产乙酸菌分离困难。

发明内容

降解丁酸的产甲酸产乙酸菌的分离方法，步骤如下：

1、菌悬液A制备：取具有产甲烷功能的厌氧活性污泥，接入装入玻璃珠的灭菌血清瓶中，通入氮气后在35-38℃、100-150r/min的条件下振荡1-3h；

2、富集菌悬液B：

a．取适量菌悬液A，接入装有富集培养基的灭菌血清瓶中，持续通入氮气0.5-1h后，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下进行富集培养；

b．当富集培养基中底物丁酸降解率≥90%时，挑选底物降解快、甲烷产量大的培养物，转接入新的富集培养基，持续通入氮气0.5-1h，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下再次进行富集培养；

c．重复上述b步骤3-5次，获得产甲酸产乙酸菌互营共培养体富集菌悬液B；

3、富集菌悬液C：

a．将富集菌悬液B接入装有分离液体培养基的灭菌血清瓶中，同时加入终浓度为10mmol/L的2-溴乙烷磺酸钠（2-BES）抑制产甲烷作用，持续通入氮气 0.5-1h，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下进行培养；