[发明专利]一种降解丁酸的产甲酸产乙酸菌的分离方法

权利要求书

1.一种降解丁酸的产甲酸产乙酸菌的分离方法，包含如下步骤：

(1)、菌悬液A制备：取具有产甲烷功能的厌氧活性污泥，接入装入玻璃珠的灭菌血清瓶中，通入氮气后在35-38℃、100-150r/min的条件下振荡1-3h；

(2)、富集菌悬液B：

a.取适量菌悬液A，接入装有富集培养基的灭菌血清瓶中，持续通入氮气0.5-1h后，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下进行富集培养；

b.挑选底物降解快、甲烷产量大的培养物，转接入新的富集培养基，持续通入氮气0.5-1h，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下再次进行富集培养；

c.重复上述b步骤3-5次，获得产甲酸产乙酸菌互营共培养体富集菌悬液B；

(3)、富集菌悬液C：

a.富集菌悬液B接入装有分离液体培养基的灭菌血清瓶中，同时加入终浓度为10mmol/L的2-溴乙烷磺酸钠(BES)抑制产甲烷作用，持续通入氮气0.5-1h，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下进行培养；

b.挑选底物降解快、甲酸产量大、不产甲烷的培养物种量到新的含有分离液体培养基和终浓度为10mmol/LBES的灭菌血清瓶中，持续通入氮气0.5-1h后，在pH为6.9-7.2、温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下再次进行富集培养；

c.重复上述b步骤3-5次，获得产甲酸产乙酸菌富集菌悬液C；

(4)、FPAs的纯培养物：

a.将富集菌悬液C接种至含有分离固体培养基的厌氧管中，在35-38℃生化培养箱中培养至菌落出现；

b.在氮气的保护下，挑选出单菌接种至分离液体培养基，将挑选的菌落在温度为35-38℃、震荡速度为100-150r/min的条件下震荡培养20-30天，选取快速降解巴豆酸产甲酸和乙酸的培养物再滚管纯化；

c.重复上述b步骤3-5次，获得FPAs的纯培养物；

上述培养基配方如下：

富集培养基：丁酸钠1.375g，甲酸钠8.5g，KH₂PO₄ 0.6g，Na₂HPO₄1.68g，NH₄Cl 0.3g，NaCl0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgCl₂·6H₂O 0.1g，Na₂S·9H₂O 0.24g，L-半胱氨酸0.5g，酵母浸粉0.5g，胰蛋白胨0.5g，0.1％刃天青溶液1mL，微量元素液1mL，维生素溶液1mL，用蒸馏水定容至1000mL，并加入适量NaHCO₃调节pH至7.5-8.0；

分离液体培养基：巴豆酸1.343g，KH₂PO₄ 0.6g，Na₂HPO₄ 1.68g，NH₄Cl 0.3g，NaCl 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgCl₂·6H₂O 0.1g，Na₂S·9H₂O 0.24g，L-半胱氨酸0.5g，酵母浸粉0.5g，胰蛋白胨0.5g，0.1％刃天青溶液1mL，微量元素液1mL，维生素溶液1mL，用蒸馏水定容至1000mL，并加入适量NaHCO₃调节pH至7.5-8.0；

分离固体培养基：预先在厌氧培养管中加入0.1g的琼脂粉，再加入4.5ml分离液体培养基；

微量元素液(g/L)：FeCl₂·4H₂O，2；H₃BO₃，0.05；ZnCl₂，0.05；CuCl₂·2H₂O，0.03；MnCl₂·4H₂O，0.05；(NH₄)6Mo₇O₂₄，0.05；AlCl₃，0.05；CoCl₂.6H₂O，0.05；NiCl₂，0.05；

维生素溶液(mg/L)：生物素，2；叶酸，2；B₆，10；B₂，5；B₁，5；B₁₂，5；烟酸，5；对氨基苯甲酸，5；硫辛酸，5；泛酸，5；

PYG液体培养基：蛋白胨20g，葡萄糖5g，酵母浸粉10g，氯化钠0.08g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，氯化钙0.008g，硫酸镁0.008g，磷酸氢二钾0.08g，磷酸氢钠0.4g，加热溶解于520mL蒸馏水中，115℃高压灭菌15min，加入过滤除菌的维生素K1溶液0.5mL和氯化血红素溶液2.5mL混匀；

维生素K₁溶液：取维生素K₁ 1g，加入无水乙醇99mL，过滤除菌；

氯化血红素溶液：取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，冰箱保存。