[发明专利]利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。

背景技术

传统的制革工艺会产生大量污染，制革排放的特色四废分别是：废水、污泥、废气和固体废弃物。其中各类污染的排放以水场部分的传统灰碱法脱毛环节为甚，灰碱毁毛脱毛法脱毛效果虽好，但被溶解的毛被、表皮与灰碱等污染物占制革废水总污染物的40％。近年来研究的清洁脱毛工艺主要有酶法脱毛、灰碱法基础上的保毛脱毛、有机胺脱毛、过氧化氢氧化脱毛和其他脱毛方法。

中性蛋白酶(Neutral protease)是在中性pH条件下作用于蛋白质肽键的酶类，能将蛋白质水解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸，可广泛用于动植物蛋白水解，皮革脱毛、软化，羊毛丝绸脱胶等。蛋白酶法脱毛制革因脱毛条件温和，对真皮中角蛋白水解少，且毛从表皮分离回收，是目前为止最有可能代替灰碱法实现清洁脱毛工业化的方法。1398、2709蛋白酶制剂在20世纪初期曾作为脱毛酶应用在制革工艺中，但因其酶系中含有水解皮胶原的胶原蛋白酶，在大规模应用中如工艺控制不严会造成松面、烂皮现象；而纯化去除胶原蛋白酶所增加的工艺成本超出了制革厂的负荷，进而限制了蛋白酶制剂在皮革工业中的应用。有研究表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis S14、Bacillus subtilis P13)及沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis LAU13)等菌株发酵生产的角蛋白酶对胶原蛋白水解能力相对较差，但在脱毛工艺中仍需要严格控制酶用量及脱毛时间，否则依旧会影响成革质量。因此，亟需研制一种理想的脱毛用酶产品，实现制革行业的“节能减排”、“低碳经济”，以促进制革业转型期保持稳定发展。

为了高效表达中性蛋白酶基因，科研工作者做了很多试验。《枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达》(《基因组学与应用生物学》；2017年03期P906-910)中通过构建大肠杆菌原核表达载体pET30b-nprE，转化大肠杆菌BL21中得到重组工程菌，初步发酵酶活为39U/mL；《枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》(《云南师范大学学报》；第25卷第3期P51-P56；2005年5月)中将编码枯草芽孢杆菌AS1.398的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中，电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168，通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子，最后获得发酵酶活为20000U/mL的重组菌株。然而上述方法均存在弊端，转化到大肠杆菌中容易有包涵体的形成，且需要破壁来获得酶，这些不但会降低酶活而且限制了酶的分泌表达；转化到毕赤酵母中需要甲醇来诱导产酶，然而甲醇极易蒸发、难以检测浓度、反复添加不但操作麻烦，而且容易发生污染、另外在大量甲醇存在下会形成火灾隐患，且不宜于食品等蛋白生产。

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白质较理想的宿主。它是一种安全的表达系统，其安全程度可以达到食品级，这是一般原核表达系统无法比拟的；具有很强的蛋白质分泌功能，蛋白质在细胞内合成后，可以通过特定机制(分泌途径)输出到细胞外培养基中。提取不需要破碎细胞，仅需较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质；没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体；发酵条件简单，产物易于分离纯化。

分子伴侣(molecular chaperones)是细胞中一大类蛋白质，是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。研究表明，分子伴侣能够帮助蛋白正确折叠，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成。Pfeffer等在E.coli表达目的蛋白的同时表达分子伴侣蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表达比例；张海军等在原核表达体系中加入HG-PGR07分子伴侣质粒与重组质粒pET-32-pfu共表达，使HG-PGR07表达的分子伴侣蛋白能够有效促进Pfu酶的可溶性表达和酶活性提高；万娟等的研究表明，pET-28a-med-ORF8与分子伴侣质粒pTf16共表达后，有效减少了包涵体的形成，提高了可溶性表达量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因。

本发明的目的之二在于提供一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种利用中性蛋白酶基因编码的蛋白。